环状RNA的体外构建及表达

目的 利用真核生物mRNA成熟过程中内含子外显子置换（permuted intron exon,PIE）策略，构建可在体外环化（in vitro cyclization,IVC）并具有翻译功能的RNA，转染HEK-293T细胞后进行表达。方法 选取具备Ⅰ型催化内含子（groupⅠcatalytic intron）的5’和3’环化臂、柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3MK-1775临床试验,CVB3)的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site,IRES）以及目的基因序列构建模板质粒，通过PCR法获得线性化质粒模板，经体外转录（in vitro transcription,IVT）合成线性RNA，依次添加环化试剂完成IVC得到环状RNA(circular RNwww.selleck.cn/products/valemetostat-ds-3201A,circRNA)。采用琼脂糖凝胶电泳及核糖核酸酶R(ribonuclease R,RNase R)消化的方式确认RNA环化。将分别携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）、萤火虫荧光素酶（firefly luciferase,Fluc）及流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）(IVR-180)的circRNA转染HEK-293T细胞，逐一验证其体外表达情况。结果 RNA环化后电泳主条带变小，且出现环化产生的小片段，经RNase R消化，仅环化后RNA条带仍有部分保留。转染EGFP-circRNA的HEK-293T细胞荧光显微镜下可见明显绿色荧光；转染Fluc-circRNA的HEK-293T细胞Fluc表达值平均为未环化RNA的20倍以上，且随Fluc-circRNA转染剂量的升高，荧光数值（relative light unit,RLU）呈上升趋势；Western blot分析显示，转染HAcircRNA的HEK-293TTopical antibiotics细胞成功表达了HA蛋白。结论 在体外成功环化了线性RNA并完成不同蛋白的表达，为新型流感疫苗及mRNA疫苗的研究奠定了基础。