玉米(Zea Mays)是重要的粮食、饲料和经济兼用作物,在粮食安全和国民经济中占有重要地位。玉米籽粒发育情况是决定其产量和品质的重要因素,一直是科研人员关注的重点领域。利用种子发育突变体,一些籽粒发育相关基因被相继克隆,对玉米籽粒发育的遗传调控有了一定的了解,然而玉米种子发育是一个多基因协同调控的复杂过程,目前其遗传调控网络还相当不完善。筛选新的籽粒发育突变体,开展重要功能基因的挖掘和作用机制研究,将促进籽粒发育遗传调控网络的解析,为玉米产量和品质性状分子设计改良提供候选基因和理论依据。前期,实验室利用EMS诱变筛selleck抑制剂选获得了一个种子发育突变体dek570-1,该突变体的种子明显变小,利用dek570-1与自交系W64A构建了 F2定位群体。本论文图位克隆了目的基因Dek570-1,并对其进行了初步的功能研究。具体结果如下:1、突变体dek5 70-1的形态学鉴定突变体dek570-1籽粒较野生型籽粒显著减小,中部纵切观察发现突变体的胚乳和胚的面积比野生型的均明显变小,但胚的形态结构似乎正常。萌发实验显示,绝大多数突变体籽粒能够萌发,突变体植株矮小、叶片发黄,但仍可生长和繁殖后代。上述结果表明,Dek570-1突变使玉米籽粒及植株的生长发育能力明显弱化。2、突变体dek570-1的遗传学分析W64A × dek5 70-1F2分离果穗上,正常籽粒与突变籽粒的分离比大约为3:1,卡方检验结果表明突变体dek5 70-1的小种子表型是由单个核基因控制的隐性性状。3、Dek570-1的图位克隆与验证以W64A×dek570-1 F2分离果穗上突变籽粒的基因组DNA为模板,筛选Indel标记将突变基因定位至Chr1上641.21 kb的物理区间内,该区间内含有16个预测基因。测序比对发现,与野生型相比只有Zm00001d028422基因在突变体dek570-1中起始密码子ATG下游的第966个碱基发生了 G-A的替换,导致蛋白翻译提前终止,并通过等位测试验证了目的基因的正确性。目前正在通过CRISPR/Cas9技术敲除Dek570-1,以进一步明确Dek570-1的功能。4、Dek570-1的表达模式和亚细胞定位PF-07321332使用方法qRT-PCR分析表明,Dek570-1在检测的玉米各组织中均表达,其中在雌穗中表达强度最高,在籽粒早期发育阶段也具有较高水平的表达,随着籽粒发育进程其表达水平逐渐下降,表明Dek570-1可能在雌穗及籽粒早期发育中发挥重要作用。亚细胞定位结果表明,Zheng58中的Dek570-1蛋白既定位于线粒体,也定位于叶绿体。5、不同遗传背景下,Dek570-1突变对玉米籽粒发育的影响授粉16天籽粒的石蜡切片显示,突变体dek570-1(Zheng58遗传背景)和等位突变体emp17(W22遗传背景)的胚乳和胚的面积比来源亲本(野生型)的明显更小,胚乳储藏物质累积减少,胚的发育受到严重影响。值得注意的是,dek5 70-1的胚虽然比野生型的明显更小,但形态结构似乎完整,而emp17籽粒未发育出完整形态结构的胚,这与授粉24天的dek570-1的胚能够萌发,而emp17胚致死的结果一致。上述结果预示着Dek5 70-1在玉米籽粒发育中的生物学功能既具有保守性,也存在一定的遗传背景差异。6、Dek570-1编码一个PPR蛋白,参与线粒体和叶绿体C-to-U的编辑Dek570-1编码一个DYW型的PPR蛋白,Zheng58和W22遗传背景下,Dek570-1在线粒体ccmFC-799和nad2-677位点的C-to-U编辑是保守的,但也存在一些其它的差异编辑位点。另外,在Zheng58遗传背景下Dek570-1也参与叶绿体rpl20-308位点的C-to-U编辑,而在W22背景下Dek570-1被报道仅定位于线粒体。上述结果表明Dek570-1可能通过参与线粒体和叶绿体基因编辑调节细胞器功能,进而影响玉米籽粒发育,但在不同玉米遗传背景下也存在一定的功能差异。7、Dek570-1突变导致植株光合能力减弱由于Zheng58遗传背景下Dek570-1也定位于叶绿体,并且参与叶绿体基因的编辑,我们测定了突变体dek570-1的光合作用相关指标。与野生型相比,dek5-0-1的叶绿素含量显著减少,光合效率明显降低,表明Dek570-1突变严重影响了叶绿体的功能,这可能与dek570-1植株和籽粒发育能力减弱,叶片变黄相关。8、Dek570-1突变引起了 ROS含量的显著增加NBT和DAB染色显示,突变体dek570-1叶片和根中的ROS含量较野生型Zheng58明显升高,说明Dek570-1突变影响了线粒体和叶绿体基因的编辑,扰乱了叶绿体和线粒体的正常功能,引起了 ROS水平的大幅度升高,这可能与籽粒及植株生长发育缺陷密切相关。综上所述,突变体dek570-1籽粒和植株的生长发育能力严重弱化,实验图位克隆并验证确认了目的基因Dek570-1;Dek570-1在雌穗及籽粒早期发育表达较高,其编码一个线粒体和叶绿体双定位的PPR蛋白,参与细胞器C-to-U的编辑;Dek570-1功能缺失的植株光合能力减弱,ROS含量的显著增加,可能导致籽bacterial and virus infections粒及植株生长发育缺陷:同时Dek570-1在玉米籽粒发育中的生物学功能既具有保守性,也存在一定的遗传背景差异。本论文明确了Dek570-1在玉米籽粒发育中重要的作用,初步研究了Dek570-1调控玉米种子发育的相关机制,上述结果将促进我们对玉米种子发育调控的认识,为玉米高产育种和品质改良提供可供选择的基因资源和理论依据。