猪精液冻存技术是提高生猪养殖业产值、降低养殖风险的关键辅助技术。但由于冻精与鲜精存在平均产仔数量等育种数据上的差距,极大地限制了猪冻存精液在人工授精中的实际生产应用,其关键难题在于猪精子对低温损伤较为敏感,并且冷冻复苏致猪精子损伤的机制尚不完善,难以针对性地优化。与此同时,近年来精液的玻璃化冷冻正成为精液冷冻技术的另一热点研究方向。目前人精子玻璃化冷冻程序已经逐渐完善,冷冻技术正趋于成熟,犬、马、驴、羊等动物的精子玻璃化冷冻也取得了较好的成果。然而迄今为止猪精子的玻璃化冷冻并没有良好的技术方案,仅有零星的研究表明玻璃化冷冻后猪精子的染色质完整性与鲜精差异不显著,可以更好地对猪精子遗传信息进行保存,但精子本身的活力几乎完全丧失。因此,本研究利用代谢组和蛋白组学分析以及分子实验验证,探索冻复苏致猪精子损伤的机制,同时对猪精子的玻璃化冷冻方案进行优化,评估玻璃化冷冻对猪精子的影响,并与慢速冷冻的影响相比较,研究获得的主要试验结果如下:1.慢速冷冻损伤线粒体,导致活性氧泄露加剧,同时自由能驱动的活性氧消除被抑制利用Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)共染、DCFH-DA染色以及JC-1染色检测慢速冷冻前后的精子质量变化,发现冻融后精子质膜受损,活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高的同时线粒体膜电位水平发生了下降。添加铁离子螯合剂甲磺酸去铁胺(deferoxamine,DFO)后精子PI阳性率和ROS水平均发生显著nonviral hepatitis下降(P<0.05),但精子活率没有发生显著变化,因此消除芬顿反应无法阻止精子死亡;添加谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)类似物Ebsen后精子ROS水平显著下降(P<0.05),但精子活率没有发生显著变化,说明消除ROS诱导的脂质过氧化过程并不能增加精子的冻融后存活能力,冻融可能导致了较为复杂的代谢紊乱。因此选取了冻融后高活力以及低活力组的精子作为研究对象进行代谢组测序,对筛选出的差异代谢物进行富集分析,以探明对冻融有较高耐受力的精子的代谢特征。结果表明,冻融过程中,猪精子活力改变在代谢模式上体现为线粒体内自由能驱动的ROS消除被抑制。并且对冻融前后猪精子ATP水平进行检测也发现冻融后精子的ATP水平显著下降(P<0.05),提示可能存在冻融过程存在较为明显的线粒体损伤;同时分别检测鲜精组、冻融后高活力组、冻融后低活力组、冻融后低活力加Ebselen处理组四组的NADP~+和NADPH各自的量以及比值的变化情况,发现低活力组与鲜精组相比,NADP~+和NADPH的比值发生显著上升(P<0.05),NADPH含量发生显著下降(P<0.05),而在低活力组中加入Ebselen处理后还会进一步加剧这种情况,表明此时活性氧消除所需的自由能驱动力减少,致使NADP~+难以向NADPH转化,验证了测序分析结果,即自由能驱动的ROS消除被抑制是精子死亡的关键。2.探索和优化金属表面玻璃化冷冻精子的方法玻璃化冷冻具有冻融迅速的特点,冰晶产生较少不易损伤细胞膜结构,因此本研究采用和优化了猪精子玻璃化冷冻方法,基于球体法、薄膜法和金属表面法三种技术流程,设计了共计95种玻璃化冷冻方案,结果表明仅有基于金属表面法玻璃化冷冻(metal surface vitrification,MSV)猪精子的方案中出现存活精子。而后以成功的方案为基础,对玻璃化冷冻稀释液、冷冻前孵育时间、复苏程序和冷冻保存时间进行优化,最终的玻璃化冷冻方案可以使复苏后的精子活率最高达到9.00±0.61%,相较于目前已发表的研究文章所公布的方案,本文所优化的猪精子玻璃化冷冻方案有了一定程度的改善。3.玻璃化冷冻可以在一定程度上避免冻融导致的猪精子代谢紊乱为了评估玻璃Dinaciclib研究购买化冷冻对猪精子的影响,对MSV冻融的精子进行DCFH-DA染色以及JC-1染色,结果表明,经历MSV冻融后的猪精子,ROS水平显著低于慢速冷冻组(P<0.05),线粒体膜电位水平显著高于慢速冷冻组(P<0.05),与新鲜猪精子相比,经历MSV冻融后的猪精子ROS水平和线粒体膜电位水平不发生显著变化。针对玻璃化冷冻组与慢速冻融的猪精子高活力组以及低活力组的代谢组学分析发现,玻璃化冷冻组的代谢产物与慢速冻融的猪精子高活力组更相似。选择玻璃化冷冻组和慢速冻融的猪精子高活力组的差异代谢物进行分析时发现,富集到的代谢产物在精子中的功能与自由能驱动的ROS消除有关,具体到蛋白质学差异代谢物的分析更加明确了这一点。而后分别检测鲜精组、玻璃化冷冻组、慢速冻融的猪精子高活力组与低活力组的NADP~+和NADPH各自的量以及比值,发现NADP~+、NADP~+和NADPH的比值同样发生显著上升(P<0.05),但不同点在于,玻璃化冷冻组的NADPH含量相较于鲜精组差异不显著,说明活性氧消除所需的自由能驱动力得到维持,NADP~+正常向NADPH转化。综上所述,本研究发现慢速冻融致猪精子低温损伤,可能与线粒体致活性氧泄露有关,特别是与线粒体来源的自由能驱动的ROS消除过程效能下降有关。而经过本研究优化的基于金属表面的玻璃化冷冻方案,复苏后的猪精子活率最高可达9.00±0.61%,相较于以往的猪精子玻璃化冷冻方案有了一定改善。同时发现玻璃化冻融相较于慢速冻融可以在一定程度上避免线粒体损伤的发生,并维持活性氧消除selleck激酶抑制剂所需的自由能驱动力,避免了精子体内ROS失衡。玻璃化冻融后猪精子较为健康的代谢模式,使猪精子的玻璃化冷冻具有一定的潜在应用前景。