猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhoea virus,PEDV)是冠状病毒科的α冠状病毒,PEDV可以感染哺乳猪和仔猪,引起猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhoea PED),主要表现为呕吐、腹泻和体液流失,感染仔猪死亡率较高。2010年开始,PED疫情开始在中国爆发,严重危害了猪群健康并给国内养猪业造成了严重经济损失。目前接种灭活或减毒疫苗在预防PED发挥重要作用,但由于病毒不断变异health resort medical rehabilitation重组带来基因型的改变,且传统疫苗对流行毒株的保护效力不强,对于PED的防控效果并不理想。细胞凋亡(Apoptosis)是细胞多种死亡方式的一种,属于固有基因编码的细胞程序性死亡,贯穿于机体整个生命活动过程,在内环境稳态和生命体的发育起着重要作用。许多病毒可通过直接或间接的方式影响细胞凋亡,达到其复制和感染的目的。因此通过发现不同基因型PEDV毒株与宿主细胞凋亡之间的相互作用,加深对PEDV感染中细胞凋亡过程的认识,为深入探讨PEDV致病机理以及该病的预防和控制提供了理论支撑。为了研究PEDV CV777株和HLJ株感染IPEC-J2细胞诱导凋亡的机制,本文开展了如下研究:将PEDV CV777株和HLJ株在IPEC-J2细胞中进行适应传代。利用透射电镜和扫描电镜观察病毒感染的细胞,发现感染细胞出现明显的变形、萎缩,线粒体膨胀增大,细胞核收缩并碎裂,且后期出现凋亡小体。AO/EB染色方法检测PEDV CV777株和HLJ株感染IPEC-J2细胞后可以引起明显凋亡变化。流式细胞术检测PEDV结果表明,PEDV CV777株和HLJ株感染72h后凋亡率分别为88.1%和48.9%,PEDV CV777株和HLJ株感染IPECSB203580-J2细胞后引起细胞凋亡且呈时间依赖性。通过JC-1荧光探针来检测线粒体膜电位,结果表明PEDV感染IPEC-J2细胞24h后线粒体膜电位发生去极化,进一步验证了电镜中病毒感染细胞后线粒体发生的变化。为了探究PEDV引起IPEC-J2细胞凋亡的途径,采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测相关凋亡因子和蛋白,发现PEDV感染IPEC-J2细胞后Caspase-3/8/9、Fasl、AIF、P53、Bax、Cytc基因表达上调,Bcl-2基因表达下降;Western Blot结果显示PEDV感染后Caspase-3/8/9、Fasl、Fas蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下降。此外,转染PEDV CV777非结构蛋白基因至IPEC-J2细胞,筛选出PEDV NSP1和NSP13可以显著引起细胞凋亡,使用凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)后发现可以抑制Csapse-3的裂解和病毒N蛋白的表达,且病毒滴度也明显下降。综上所述,PEDV CV777和HLJ毒株可通过线粒体介导的内源性和死亡受体介导的外源性两种途径引起Caspase级联反应从而诱导IPEC-J2细胞凋亡;其中PEselleck CH-223191DV NSP1和NSP13可以显著引起IPEC-J2细胞细胞凋亡;且使用凋亡抑制剂抑制细胞凋亡后会抑制病毒复制。PEDV CV777在每个时间点诱导细胞凋亡数量上要多于HLJ毒株,且凋亡形态上更加明显,相关因子和凋亡蛋白表达量增加明显。