目的:从中医药理论分析,猕猴桃根配伍石韦(Actinidia chinensis Planch Root and Pyrrosia lingua(Thunb.)Farwell,AP)具有利水通淋、活血解毒等功效,民间验方中常将它们配伍使用来治疗前列腺癌症(Prostate Cancer,PProtein BiochemistryCa)。本课题利用前列腺癌细胞PC-3体外检测AP提取物对细胞增殖、迁移、凋亡等方面的协同作用,并对其成分进行分析,以期为AP治疗PCa的进一步研究开发提供参考。方法:1.AP提取物制备:采用水提、先水提后醇提、醇提提取方法,对不同配比(1:0、3:1、1:1、1:3、0:1)的猕猴桃根石韦混合物进行提取。2.药物成分分析:采用液相及液质联用方法对猕猴桃根、石韦及二者混合提取物中的有效单体成分进行定性分析。3.网络药理学分析:采用网络药理学技术研究AP治疗PCa的物质基础和作用机制。4.体外抗氧化实验:通过研究AP提取物对1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS·+)的清除能力,对15种提取物的抗氧化效果进行初步筛选。5.AP提取物对前列腺癌细胞PC-3增殖抑制效果评估:采用溴化噻唑蓝四氮唑染色法(MTT)对15种提取物及阳性药比卡鲁胺(CDX)对PC-3细胞的增殖抑制率进行检测,做剂量依赖和时间依赖实验,初步确定最佳配比。将其与CDX进行联合,检测药物联合后对PC-3细胞抗增殖协同作用,确定最佳联合组合。6.细胞迁移检测:通过细胞划痕实验,评估AP提取物组、CDX组及联合给药组对PC-3细胞迁移抑制效果,同时使用倒置相差显微镜观察PC-3细胞形态。7.细胞周期检测:采用流式细胞检测仪检测不同药物对PC-3细胞周期的影响,同时初步观察其对细胞凋亡的影响。8.细胞凋亡检测:采用TUNEL法,利用荧光素FITC进行标记,激光共聚焦显微镜观察结果,PC-3凋亡细胞为FITC阳性。9.PI3K/AKT信号通路蛋白及Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白检测:采用免疫荧光技术,利用荧光素FITC进行标记,对不同给药组细胞内PI3K/AKT信号通路蛋白及Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白水平进行评估,明确蛋白表达位置。结果:1.药物成分分析:采用UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术对三种提取物(WEAP-1-0、WEAP-3-1、WEAP-0-1)的成分进行鉴别。从三种样品中共鉴定出酚酸类、萜类、氨基酸、香豆素和黄酮等44种成分,研究报道其中咖啡酸、土荆皮乙酸等成分具有良好的抗肿瘤效果,为AP抗PCa提供参考。2.网络药理学分析:网络药理学结果显示AP主要通过减轻氧化应激、活性氧等,调节前列腺癌、细胞周期、癌症中的蛋白聚糖等通路,抑制细胞侵袭迁移和促进细胞凋亡,来发挥治疗PCa的作用。3.体外抗氧化实验:中药不同配伍均显示良好的DPPH·与ABTS·+清除能力,效果呈浓度依赖性增强,二者具有良好的量-效关系。不同配伍比例对DPPH·、ABTS·+清除效果影响由强到弱顺序为:AP-1-0>AP-3-1>AP-1-1>AP-1-3>AP-0-1;不同提取溶剂对其清除能力由强到弱顺序为:水提≈先水后醇提>醇提。4.AP提取物对前列腺癌细胞PC-3增殖抑制效果评估:15种提取物对PC-3细胞均有不同程度的增殖抑制作用,且这种作用呈现浓度依赖性。利用MTT方法筛选出的最佳药物提取组合WEAP-3-1,与CDX联合用药后能够减少药物浓度,增强对肿瘤细胞的杀伤效果,起到增效的作用。5.细胞迁移检测:CDX、WEAP-3-1及联合给药能够抑制PC-3细胞侵袭,对比单一药物两组,联合给药组划痕距离增加明显,提示联合给药组能够进一步抑制PC-3细胞的侵袭和迁移能力。6.细胞周期检测:单独给药及联合给药对PC-3细胞周期变化表现为S/G2期所占比例的减小及G1期的阻滞,经联合给药处理后,对G1期阻滞更严重,同时,单独给药及联合给药组细胞的sub G1期比例显著升高,通过将PC-3细胞阻滞在G1期,诱导其发生凋亡。7MRTX849 IC50.细胞凋亡检测:TUNEL实验结果显示实验组显绿色荧光的细胞数目显著增加,其中联合给药组荧光细胞数量增加最为显著,明显优于单独给药组,CDX与WEAP-3-1联合给药可协同促进PC-3细胞凋亡,诱导其死亡。8.PI3K/AKT信号通路蛋白及Bcl-2、Bax凋亡相关蛋白检测:免疫荧光实验结果显示,CDX与WEAP-3-1联合给药后可下调PI3K/AKT信号通路蛋白表达,可能通过激活PI3K/AKT信号通路而抑制前列腺癌细胞PC-3增殖,同时上调Bax蛋白表达水平,下调Bcl-2蛋白表达水平,表现出促凋亡效购买Ipatasertib果,且优于单药组,二者联合起到协同增效的效果,这可能与Bcl-2/Bax信号通路激活有关。结论:猕猴桃根及石韦经UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技术鉴定出44种成分,结合网络药理学研究提示AP可通过减轻氧化应激,调节前列腺癌、细胞周期等通路,抑制细胞侵袭迁移和促进细胞凋亡。体外抗氧化实验结果表明猕猴桃根、石韦对DPPH·及ABTS·+表现出良好的清除效果,具有良好的抗氧化效果。筛选出的最佳组合WEAP-3-1与CDX联合给药后协同抑制PC-3细胞增殖及迁移,且效果优于单药组,联合给药处理后细胞内PI3K/AKT信号通路蛋白表达降低,凋亡相关蛋白Bax表达水平升高,Bcl-2表达水平降低,说明其可能通过激活PI3K/AKT及Bcl-2/Bax信号通路发挥其作用。