目的:通过采用Con A尾静脉注射的方式建立自身免疫性肝炎(AIH)小鼠模型,在明确片仔癀(PZH)治疗AIH疗效的同时,从调控巨噬细胞极化的角度探索其可能的作用机制。方法:1、动物模型复制和给药方法:60只SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分成6组,即正常组、模型组、片仔癀低、中、高剂量组(PTH-L、PTH-M、PTH-H)和地塞米松(DXM)组,每组10只。适应性喂养3天后,每天固定时段给药,共预防性给药10天。正常组及模型组用等体积0.9%氯化钠溶液灌胃处理,片仔癀低、中、高剂量组组分别采用片仔癀117 mg/kg、234 mg/kg及468 mg/kg灌胃处理,地塞米松组给予地塞米松3 mg/kg腹腔注射。末次给药3h后,采用经典的刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)尾静脉注射复制AIH模型。除正常组小鼠注射0.2 mL的0.9%氯化钠溶液外,其余各组小鼠均尾静脉注射Con A 15 mg/kg,一次即可,禁食不禁水。8 h后处死,采集小鼠外周血和肝、脾组织。2、片仔癀对刀豆蛋白A诱导的AIH小鼠的疗效评价:每日同一时间段观察与记录各组小鼠的体重变化、毛发色泽、活动程度和精神状态等情况。将小鼠麻醉安乐死以后摘取脾脏和肝脏组织,并称重记录。后续计算脾重、肝重、脾重指数、肝重指数等。制备肝脏组织病理切片,光学显微镜下观察各组肝脏的病理状况,并采用双盲法对其进行病理损伤评分。制备小鼠外周血血清进行肝功能检测,检测指标为 ALT、AST、DBIL、IBIL、TBIL、ALP、ALB、GOLB、CHOL、GGT、LDL-C、HDL-C、TP和TG。此外,我们还采用Elisa法检测小鼠肝脏组织中IL-4、IL-10、TGF-β、IL-6、IL-12、IL-17 和 IFN-γ细胞因子水平。3、片仔癀对AIH小鼠M1/M2型巨噬细胞的调控作用:采用流式术检测小鼠肝脏组织中的M1型巨噬细胞(CD11b+、F4/80+iNOS+、CD11b+F4/80+TIM-1+、CD11b+F4/80+TLR4+和 CD11b+F4/80+MHC-II+)及 M2 型巨噬细胞(CD11b+F4/80+CD163+、CD11b+F4/80+CD206+)水平,以探究片仔癀治疗AIH的免疫性机制。4、片仔癀对AIH小鼠mTOR信号通路的调控:采用Western blot法检测mTOR信号通路相关蛋白的表达,来探究LY2157299化学结构片仔癀对AIH小鼠mTOR信号通路的调控作用。结果:1、片仔癀对刀豆蛋白A诱导的AIH小鼠的药效学评价:与正常组相比,模型组小鼠出现明显的体重下降,显著的精神萎靡,食欲下降,毛发光泽度受损;脾重和肝重明显增加,肝重指数及脾重指数也显著上升(p<0.01)。而与模型组相比,治疗组的各项症状有所缓解,脾重、肝重、肝重指数、脾重指数显著降低(p<0.01或p<0.05)。提示片仔癀可以有效改善实验性AIH小鼠的症状。镜下观察肝脏病理切片发现,正常组小鼠肝脏结构清晰,肝细胞完整,肝索排列整齐,无明显异常。而与正常组相比,模型组肝小叶结构可见严重破损,肝索排列失序,大量炎性细胞浸润和部分坏死,并见玫瑰花结样改变,模型组病理损伤评分也显著升高(p<0.01)。而片仔癀低中高剂量组及地塞米松组的肝脏结构均有不同程度的修复,肝细胞的炎症浸润及坏死程度减轻,且病理损伤评分明显下降(p<0.01 或p<0.05)。肝功能检测发现,与正常组比较,模型组小鼠血清中ALT、AST、DBIL、IBIL、TBIL、ALP、LDL-C和TG水平均显著升高(p<0.01);与模型组比较,各治疗组的上述肝功能指标水平均有明显下降(p<0.01或p<0.05)。同时,与正常对照组比较,模型组小鼠血清中的ALB、GLOB、CHOL、GGT、HDL-C及TP水平均显著下降(p<0.01或p<0.05),而各治疗组相对应的肝功能指标也有不同程度的上升(p<0.01 或p<0.05)。Elisa检测小鼠肝脏组织中的抑炎细胞因子和促炎因子时可发现,与正常组相比较而言,模型组小鼠中IL-4、IL-10和TGF-β的表达水平明显降低(p<0.01),而IL-6、IL-12、IL-17和IFN-γ的表达量明显升高(p<0.01)。而各治疗组小鼠经片仔癀低、中、高剂量和地塞米松治疗后,IL-4、IL-10和TGF-β的表达水平明显升高(p<0.01),IL-6、IL-12、IL-17 和IFN-γ的表达量明显下降(p<0.01 或p<0.05)。2、片仔癀对AIH小鼠巨噬细胞的调控作用:与正常组相比,模型组M1型巨噬细胞 CD11b+F4/80+iNOS+、CD11b+F4/8Biosynthetic bacterial 6-phytase0+TIM-1+、CD11b+F4/80+TLR4+和CD11b+F4/80+MHC-Ⅱ+细胞数量明显上升(p<0.01),而M2型巨噬细胞CD11b+F4/80+CD163+、CD11b+F4/80+CD206+细胞数量明显下降(p<0.01)。与此同时,各治疗组小鼠经片仔癀中剂量和地塞米松治疗后,M1型巨噬细胞CD11b+F4/80+iNOS+、CD11b+F4/80+TIM-1+、CD11b+F4/80+TLR4+和 CD11b+F4/80+MHC-Ⅱ+细胞数量显著下降(p<0.01或p<0.05),而M2型巨噬细胞CD11b+F4/80+CD163+、CD11b+F4/80+CD206+细胞数量明显上升(p<0.01)。提示片仔癀可有效调控自身免疫性肝炎小鼠M1/M2型巨噬细胞平衡。3、片仔癀对AIH小鼠mTOR信号通路的影响:与正常组相比,模型组小鼠肝脏组织中P53的表达水平显著下降(p<0.01),而ERK1/2、Akt、p-Akt和PI3K的蛋白量明显上升(p<0.01)。在片仔癀和地塞米松两个治疗组中,P53的表达水平显著上升(p<0.01),而ERK1/2、AkGPCR & G Protein抑制剂t、p-Akt和PI3K的蛋白量明显下降(p<0.01或p<0.05)。提示片仔癀可有效抑制AIH小鼠mTOR信号通路的活化。结论:1、片仔癀可有效地缓解Con A诱导的AIH小鼠症状。2、片仔癀中剂量治疗AIH的疗效较佳;3、片仔癀有效调控AIH模型小鼠外周血中M1和M2型巨噬细胞平衡,这可能与抑制mTOR信号通路活化有关。