丙烷脒是结RSL3体外构新颖且具有自主知识产权的烷基脒类杀菌剂,对多种病原菌均具有较强的抑制作用,特别是对不同抗药性背景的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)均具有较好的抑制作用,EC_(50)仅为0.87μg/m L。课题组前期通过室内药剂驯化,获得了12株丙烷脒高抗菌株。Lapatinib浓度采用全基因组重测序分析发现,与亲本菌株B05.10相比,12株丙烷脒高抗菌株中存在32个共有SNP位点,突变位点分布于外显子、内含子、基因间及UTR区等,其中有9个位于外显子区域的共有非同义单点突变基因,上述突变基因与生物体内多种代谢途径相关。靶标基因突变是引起病原菌对杀菌剂产生高水平抗性的主要机制,因此我们推测灰葡萄孢对丙烷脒高水平抗性的产生可能是由于上述基因突变导致的。基于此,本研究选取BCIN-16g04050(A)、Bcnew1(C)、BCIN-12g06020(F)、BCIN＿01g04190(H)、BCIN＿14g05250(K)、BCIN＿12g03280(L)、Bcdsf2(M)、BCIN＿01g05760(N)、Bcpmr1(Q)9个位于外显子区域的共有SNP位点所在基因,进行抗性菌株与敏感菌株之间的双向基因替换;比较分析亲本菌株与基因替换突变体对丙烷脒敏感性变化及其他生物学性状差异,旨在揭示灰葡萄孢对丙烷脒抗药性分子机制,也为深入解析丙烷脒抑菌分子机制及其科学合理使用提供理论依据。主要结果如下:(1)采用融合PCR(Double-joint PCR)的方法,构建出9个位于外显子区域的单点突变基因替换载体。(2)采用PEG介导的原生质体转化方法,完成9个基因分别从抗性菌株替换到敏感菌株,并通过50μg/m L潮霉素抗性targeted immunotherapy板筛选、PCR验证及测序验证,成功获得A40、C18、F21、H51、K53、L24、M20、N11、Q27 9株基因替换突变体。敏感性及表型测定结果表明,9株突变体的EC_(50)值介于2.08-19.80μg/m L,与亲本菌株相比,其抗性倍数介于1.73-16.50倍之间。依据侯军对灰葡萄孢抗药性水平的划分标准,共得到一株中水平抗药性突变体F21,三株低水平抗药性突变体K53、M20、Q27,5株敏感突变体。同时将敏感菌株未突变的9个基因分别同源替换到抗性菌株中,成功获得A7、C2、F33、H17、K3、L8、M41、N34、Q16 9株基因替换突变体。药剂敏感性测定结果表明,9株突变体的EC_(50)值介于68.91-160.16μg/m L,抗性倍数介于57.43-133.46倍之间。突变体较原始抗性菌株R19的抗性倍数(140.73倍)均有不同程度降低,其中F33 EC_(50)为59.19μg/m L,相对于R19的EC_(50)(160.87μg/m L)下降59.19%,抗性倍数由140.73倍下降到57.43倍。以上结果表明BCIN-12g06020这个基因在灰葡萄孢对丙烷脒产生高水平抗性中起到关键作用。(3)通过对基因替换突变体的生物学性状测定,发现与亲本菌株B05.10相比,突变体C18与F21菌丝生长速率、致病力、孢子萌发率下降,但产孢量显著上升;突变体M20、Q27菌丝生长速率以及致病力下降;突变体N11致病力显著下降。与其相对应的,以R19为亲本获得的基因替换突变体C2、F33、M41、N34、Q16生物学性状变化趋势相反。表明9个共有突变基因中Bcnew1(C)、BCIN-12g06020(F)、Bcdsf2(M)、BCIN＿01g05760(N)、Bcpmr1(Q)5个基因的点突变对灰葡萄孢生物学性状有较为显著的影响。综上所述,本研究明确了抗性菌株中位于外显子上9个共有SNP位点对灰葡萄孢抗药性产生的影响,其中BCIN-12g06020基因编码假定的质膜H~+-ATP酶,由于其功能重要性和种属特异性,质膜H~+-ATP酶也被认为是广谱抗真菌药物研发的重要靶点。在该基因上出现的SNP位点对灰葡萄孢抗药性产生的影响最为显著,因此,我们认为该基因点突变是引起灰葡萄孢对丙烷脒产生抗药性的主要因素,其他共有SNP位点的叠加效应也可引起灰葡萄孢对丙烷脒产生抗药性,最终导致灰葡萄孢对丙烷脒产生高水平抗药性。此外,灰葡萄孢生物学适合度下降可能是由多个SNP位点共同作用的结果,其中BCIN-12g06020(F)基因的SNP位点对亲本菌株生物学性状影响较为显著,BCIN＿01g05760(N)基因与灰葡萄孢致病力密切相关。