灰肉红菇多糖的结构表征及其基于免疫调节的促造血功能研究

在临床上使用化疗药物时,常常会通过对正常细胞的基因组进行修饰从而引发机体的免疫抑制,甚至造血功能障碍,产生严重的副作用。目前常用的缓解免疫抑制或造血功能障碍的手段主要包括手术、化学合成药物治疗、细胞因子治疗,但是这些方法易引发机体感染,药理作用不够明显,具有一定的局限性。食药用菌是天然来源的、具有多种药理活性且毒副作用小的大型真菌,其中多糖组分更是因具有构型丰富、多靶点等特点,常常用于功能性食品或药物的开发中。灰肉红菇(Russula griseocarnosa)是一种外生菌根的食药用菌,主要分布在我国福建省等地。目前有研究显示,灰肉红菇中的多糖组分在体外实验中展示出良好的免疫调节能力,但是多糖的结构解析不够深入、同时其在动物水平的免疫调节活性及更深层次的促造血功能仍未见报道。因此,本研究以灰肉红菇为研究对象,对其中的多糖组分进行分离和纯化,探究不同多糖组分在结构组成上的差异,并结合免疫功能低下小鼠模型和造血功能障碍小鼠模型,探究灰肉红菇多糖缓解化疗所致的造血功能障碍的作用机制。首先,本研究分析了灰肉红菇中的主要成分组成,结果发现其中包含44.6%总膳食纤维、30.9%总蛋白、27.1%总糖、13.45%甘露醇、6.9%总灰分、2.8%粗脂肪、0.74%总生物碱、0.51%总多酚、0.43%总三萜、0.4%总皂苷、0.35%可溶性蛋白和0.3%总甾醇。同时还发现,其中含有谷氨酸等17种氨基酸,C15:0等6种脂肪酸,锰等8种矿物质元素,且重金属含量低于国家规定的菌物中重金属selleckchem PLX5622限量,证明灰肉红菇是一种物质组成丰富、多糖占比较高、且具有一定安全性的食药用菌。结合单因素实验和响应面设计,确定热水浸提activation of innate immune system法提取灰肉红菇多糖的提取条件:液料比30:1、提取温度80℃,提取时间3 h,经Sevag法除蛋白、醇沉法得到其中的粗多糖组分,并结合层析法对不同的多糖组分进行分离和纯化,最终得到两种多糖组分,将它们命名为RGP1和RGP2。进一步结合分子量检测、单糖组成分析、色谱-质谱联用、核磁共振分析,确定两种多糖在结构组成上的差异:RGP1分子量为31.4 k Da,主要由5种单糖组成,且摩尔比为半乳糖(Galactose,Gal):3-O-甲基(Methyl,Me)-Gal:葡萄糖(Glucose,Glc):甘露糖(Mannose,Man):岩藻糖(Fucose,Fuc)=25.77:8.37:2.51:1.52:1.41,是以1,6-α-Galp为主链的半乳聚糖,在部分O-3位存在甲基取代,在部分O-2位存在α-Fucp取代、或与→6)-α-Galp-(1→或→6)-α-O-Me-Galp-(1→相连的α-Fucp取代;RGP2分子量为11.8 k Da,主要由4种单糖组成,且摩尔比为Glc:Gal:Man:葡萄糖醛酸(Glucuronic acid,Glc A)=30.62:3.43:1.90:1.41,是以→6)-β-D-Glcp-(1→重复连接或与→6)-α-D-Galp-(1→连接为主链的葡聚糖,在→6)-β-D-Glcp-(1→的部分O-3位存在β-D-Glcp-(1→取代。结构分析的结果表明,RGP1和RGP2在结构组成上存在显著差异,这可能会导致二者药理活性的不同。接下来,在75 mg/kg环磷酰胺构建的免疫功能低下小鼠模型中筛选RGP1和RGP2的免疫调节活性,结果显示,RGP1和RGP2均改善了模型小鼠脾脏指数的升高,缓解了脾小结生发中心的扩张以及中性粒细胞的浸润,恢复小鼠脾脏NK细胞的杀伤活性和T淋巴细胞转化能力;但是通过细胞因子检测发现,与RGP2相比,RGP1能够更加显著地提高免疫功能低下小鼠脾脏中免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)A、Ig G、Ig M、白细胞介素(Interleukin,IL)-4、IL-6、干扰素γ、肿瘤坏死因子α等细胞因子的含量,由此可以发现,RGP1具有更好的调节免疫的能力。因此,进一步通过肠道菌群和血清代谢组学分析RGP1免疫调节的可能机制。肠道菌群的分析结果显示,RGP1能够显著调节模型组小鼠中Lactobacillus、Faecalibacterium、Odoribacter等菌属的丰度,肠道微生物介导的代谢通路更是直接富集在免疫调节上。此外,代谢组学的分析结果显示,RGP1显著改变了模型组小鼠中L-kynurenine、Uridine、AcetylchoAY-22989溶解度line等20种代谢物的水平,且丰度显著改变的菌群与血清代谢物之间存在着显著的关联,深入探究作用机制发现,RGP1的免疫调节活性主要在于其对T细胞分化的调节。进一步,结合100 mg/kg环磷酰胺构建的造血功能障碍小鼠模型探究RGP1的促造血活性和相关机制,结果发现,RGP1缓解了造血功能障碍小鼠体重的降低和脾脏指数的升高、以及模型组小鼠骨髓空泡化、排列稀疏等病理学变化,增加了模型组小鼠长期造血干细胞、活化的T细胞和分化簇(Cluster of differentiation,CD)4~+T细胞的数量,调节外周血细胞的水平,而不影响小鼠骨髓中自然杀伤细胞和B细胞的数量,这些结果初步证明RGP1具有良好的促造血作用。通过蛋白质组学技术深入挖掘相关作用机制,结果发现组间显著改变的蛋白富集的通路主要集中在CD4受体结合、T细胞活化和造血调节之上,这与前面的结果一致。细胞因子检测的结果证实,RGP1促进了CD4~+T细胞中造血相关细胞因子的分泌(IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等),而这些因子又会进一步激活酪氨酸激酶(Janus kinase,JAK)/信号传导及转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)3通路,促进下游c-Myc的表达。总之,RGP1主要是通过促进CD4~+T细胞的分化和JAK/STAT3通路发挥促造血活性。综上所述,本研究的结果表明:(1)灰肉红菇中富含多种营养成分和活性组分,且多糖含量较高,适用于多糖的提取和活性探究;(2)灰肉红菇中含有两种主要的多糖组分,且它们的分子量和结构组成差异较大;(3)与RGP2相比,RGP1具有更好的免疫调节活性,相关的机制可能与调节T细胞分化相关;(4)RGP1能够缓解化疗诱导的小鼠造血功能障碍,相关机制可能在于促进CD4~+T细胞的分化并激活JAK/STAT3通路。本研究的结果将为临床上缓解化疗诱导的造血功能障碍、以灰肉红菇多糖为主成分的功能性食品或临床辅助药物的开发提供数据支持。