目的:甲基汞(Methylmercury,MeHg)是一种对中枢神经系统有着很强的毒性的重金属,易导致神经发育和神经退行性疾病medicine beliefs的发生,最新的研究表明,溶酶体靶向治疗可能对神经退行性疾病是一种有用的辅助治疗。甲基汞是否能够导致细胞衰老以及溶酶体功能损伤在甲基汞所致衰老SH-SY5Y细胞中的具体机制尚Protein Tyrosine Kinase抑制剂不清楚。褪黑素(Melatonin,MT)是松果腺的一种主要分泌产物,对神经系统具有保护作用,褪黑素在其中的干预作用尚不清楚。方法:1.浓度与分组(1)MeHg暴露实验:采用不同剂量MeHg(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4μmol·L~(-1))处理SH-SY5Y细胞48 h,细胞活性检测试剂盒(CCK-8法)检测细胞活性并计算存活率,采用β-半乳糖苷酶染色法(SA-β-gal)检测衰老细胞情况并观察细胞形态,从而筛选出可明显引起SH-SY5Y细胞衰老的MeHg剂量(即0.5μmol·L~(-1)),并采用其1/2和1/4的剂量(即0.25和0.125μmol·L~(-1))分别作为中、低剂量组。(2)TFEB activator 1干预实验:将SH-SY5Y细胞分为对照组(0.1%DMSO)、染汞组(0.5μmol·L~(-1)MeHg)、TFEB activator 1组(1μmol·L~(-1)TFEB activator 1预处理细胞12 h)、TFEB activator 1+MeHg组(1μmol·L~(-1)TFEB activator 1预处理细胞12 h后0.5μmol·L~(-1)MeHg染毒48 h)。(3)氯喹(Chloroquine,CQ)干预实验:将SH-SY5Y细胞分为对照组(0.1%DMSO)、染汞组(0.5μmol·L~(-1) MeHg)、CQ组(10μmol·L~(-1)CQ预处理细胞1 h)、CQ+MeHg组(10μmol·L~(-1)CQ预处理细胞1 h后0.5μmol·L~(-1) MeHg染毒48 h)。(4)MT干预实验:将SH-SY5Y细胞分为4组:对照组(0.1%DMSO)、染汞组(0.5μmol·L~(-1)MeHg)、MT组(1 mmol·L~(-1)MT预处理细胞24 h)、MT+MeHg组(1 mmol·L~(-1)MT预处理细胞24 h后0.5μmol·L~(-1)MeHg染毒48 h)。2.研究方法(1)β-半乳糖苷酶染色观察SH-SY5Y细胞衰老变化(2)Western blot检测衰老相关蛋白p16;周期有关蛋白E2F1;自噬相关蛋白p62、LC3以及溶酶体相关蛋白LAMP1、LAMP2、TFEB的表达水平(3)流式细胞仪检测细胞周期(4)溶酶体红色荧光探针染色检测溶酶体数量;Lyso Sensor Green DND-189绿色溶酶体荧光探针染色检测溶酶体p H变化(5)电镜观察溶酶体形态学变化结果Berzosertib:1.MeHg可诱导SH-SY5Y细胞衰老CCK-8结果表明,随着染毒浓度增加细胞活性降低;与对照组相比,0.5μmol·L~(-1)MeHg染毒组β-半乳糖苷酶蓝染细胞率明显增多了48%(P<0.01),光学显微镜下观察到对照组SH-SY5Y细胞形态呈梭形而0.5μmol·L~(-1)MeHg处理组细胞呈扁平,细胞体积增大,呈现出衰老表型。与对照组相比,0.25和0.5μmol·L~(-1)MeHg染毒组p16蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05),细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05),E2F1蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。2.MeHg诱导SH-SY5Y细胞衰老与溶酶体功能损伤有关MeHg(0.125、0.25、0.5μmol·L~(-1))处理SH-SY5Y细胞48 h后,与对照组相比,0.5μmol·L~(-1) MeHg处理组自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达量显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);0.25、0.5μmol·L~(-1)剂量染毒组的p62蛋白表达量均高于对照组,并呈剂量-效应关系(P<0.05)。与对照组相比,各MeHg处理组溶酶体红色荧光探针和Lyso Sensor Green DND-189绿色溶酶体荧光探针强度均减弱,且在0.5μmol·L~(-1)MeHg处理后最明显;与对照组相比,LAMP1、LAMP2蛋白表达水平逐渐降低,在0.5μmol·L~(-1)MeHg染毒组时最明显(P<0.05);在0.5μmol·L~(-1)MeHg处理后溶酶体的重要调控因子TFEB与对照组相比发生了明显入核(P<0.05),并且细胞浆中的TFEB蛋白含量也升高(P<0.05);电镜显示与对照组相比,0.5μmol·L~(-1)MeHg处理后溶酶体体积增大。与空白对照组相比,CQ组p16、E2F1蛋白表达水平升高,具有统计学意义(P<0.05);与染汞组相比,CQ+MeHg组p16、E2F1蛋白表达水平升高,且具有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组相比,CQ组β-半乳糖苷酶蓝染细胞率明显增多了51%,具有统计学意义(P<0.01);与染汞组相比,CQ+MeHg组β-半乳糖苷酶蓝染细胞率明显增多了18%(P<0.05)。3.促进TFEB入核可干预MeHg可诱导SH-SY5Y细胞衰老通过Western blot实验检测细胞浆与细胞核中TFEB蛋白的含量,说明1μmol·L~(-1)TFEB activator 1预处理SH-SY5Y细胞12 h能有效促进Flag-TFEB的核易位,试验具有统计学意义(P<0.05);之后我们通过溶酶体红色荧光探针染色试验证明了同样剂量和时间TFEB activator 1预处理可以增加溶酶体的数量;Western blot实验检测到与0.5μmol·L~(-1)MeHg处理组相比,TFEB activator1+MeHg处理组衰老相关蛋白p16明显降低,试验具有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组相比,TFEB activator 1+MeHg处理组β-半乳糖苷酶蓝染细胞率明显减少了21%,具有统计学意义(P<0.05)。4.褪黑素可恢复溶酶体功能损伤并促进TFEB入核从而干预MeHg可诱导SH-SY5Y细胞衰老经1 mmol·L~(-1)MT干预处理24 h后,与0.5μmol·L~(-1)MeHg处理组相比,MT+MeHg组β-半乳糖苷酶蓝染细胞率明显减少了19%(P<0.01),衰老相关蛋白p16的表达明显降低(P<0.05),促使细胞从G0/G1期向S期转变(P<0.05),E2F1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),自噬相关蛋白LC3Ⅱ蛋白与p62/SQSTM表达量明显降低(P<0.05),通过溶酶体红色荧光探针染色和Lyso Sensor Green DND-189染色实验证明,MT+MeHg组溶酶体数量增加和p H值降低,溶酶体相关蛋白LAMP1与LAMP2蛋白的表达量显著升高(P<0.05),TFEB入核量明显增多(P<0.05)。结论:MeHg可能通过抑制溶酶体生物发生及损伤溶酶体活性,进而导致自噬小体降解障碍并诱导SH-SY5Y细胞衰老;而褪黑素可能通过增加TFEB入核从而促进溶酶体生物发生并促进自噬小体降解,缓解MeHg对SH-SY5Y细胞的致衰老作用,该研究可为干预MeHg诱导的神经细胞损伤提供实验依据。