目的:泽漆汤是被临床证实能够有效治疗肺癌的一种中药复方,但其作用分子机制尚未明确。本课题以非小细胞肺癌细胞株H1299、H1650和A549为研究对象,采用细胞和分子生物学技术,在体外水平探讨泽漆汤对非小细胞肺癌增殖、迁移和铁死亡的影响,阐明泽漆汤抑制非小细胞肺癌作用的分子机制,为泽漆汤治疗非小细胞肺癌提供理论依据和实验基础。方法:1.中药质谱分析泽漆汤药物成分泽漆汤样本采用超高压液相色谱仪和安捷伦SB-C18色谱柱进行分离,然后采用AB 6500 QTRAP质谱仪(AB SCIEXMK-4827供应商)进行质谱分析。2.体外水平研究泽漆汤对非小细胞肺癌的影响以非小细胞肺癌细胞株H1299、H1650和A549为研究对象,设置对照组和药物处理组。(1)MTT比色法检测泽漆汤对H1299、H1650和A549细胞增殖的影响。(2)细胞划痕实验和Transwell法检测泽漆汤对H1650和A549细胞迁移的影响。(3)流式细胞术检测泽漆汤对H1299、H1650和A549细胞周期的影响。(4)细胞衰老试剂盒检测泽漆汤对H1299、H1650和A549细胞衰老的影响。(5)活性氧试剂盒检测泽漆汤对H1299、H1650和A549细胞铁死亡的影响。3.泽漆汤抑制非小细胞肺癌的分子机制探讨运用网络药理学、RNA测序和蛋白印迹(western blotting)实验等方法探索泽漆汤抑制非小细胞肺癌的潜在靶点和作用机制。利用TCMSP和Herb数据库筛选出君药泽漆、臣药半夏和石见穿的有效化合物;再运用Herb、swiss target prediction和SEA等数据库筛选相关化合物的分子靶点。Genecard和OMIM数据库筛选出非小细胞肺癌的疾病靶点,再与筛选后的药物靶点做交集,并对交集靶点运用String和DAVID数据库构建蛋白互作及信号通路网络。将H1299、H1650和A549三株非小细胞肺癌细胞株分为对照组和泽漆汤组,提取样本的总RNA干冰寄送美吉生物公司进行RNA测序,并对获得实验结果进行分析。qPCR实验考察泽漆汤处理的H1299、H1650和A549细胞样本中GPX4和ACSL4基因的表达水平;Western blot检测泽漆汤处理后的H1299和A549细胞样本中CCND1、CDC45、MMP2、MMP9、PTGS2、GPX4和SLC7A11蛋白的表达水平。结果:1.质谱分析泽漆汤组分泽漆汤样本(冻干粉溶液)共检测出1067个代谢物,并获得9种物质一级分类,黄酮、酚酸类、生物碱、萜类、醌类、木脂素和香豆素、鞣质、甾体和其他,其中成分含量前十的物质是短叶苏木酚酸、没食子酸、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷(汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷)、金合欢素-7-O-葡萄糖醛酸苷、3-吲哚丙烯酸、4-O-没食子酰奎宁酸、3-氨基-2-萘甲酸、黄芩苷和N-苯亚甲基异甲胺,物质丰度比为1210000000、790000000、593000000、574000000、496000000、320000000、303000000、297000000、248000000、178000000、43700000。鉴定出来的成分主要来源于泽漆、半夏、石见穿和黄芩等中药。2.体外研究实验结果(1)MTT法实验结果显示,泽漆汤对非小细胞肺癌细胞株H1299、H1650和A549的增殖有明显的抑制作用(p<0.001),并随着药物浓度的升高,抑制效果更明显,呈剂量依赖性。(2)细胞划痕实验结果显示,泽漆汤对H1650和A549的横向迁移能力有明显的抑制作用,具有统计学意义(p<0.001);Transwell的实验结果显示,泽漆汤对H1299、H1650和A549的纵向迁移能力有明显的抑制作用(p<0.001)。(3)流式细胞术结果显示,泽漆汤将H1299、A549和H1650阻滞在G1期,有效抑制了肿瘤细胞增殖。(4)细胞衰老实验结果显示,泽漆汤组H1299、A549和H1650细胞衰老的数量明显多于对照组,加速了癌细胞的衰老进程。(5)活性氧实验结果显示,与对照组相比,泽漆汤组的H1299、H1650和A549细胞出现了活性氧累积。结合细胞衰老实验结果分析,泽漆汤可能是诱导肺癌细胞出现了铁死亡现象,抑制了肺癌细胞的增殖。3.泽漆汤抑制非小细胞肺癌的分子机制探讨网络药理学分析得到泽漆的有效化合物16种,半夏的有效化合物14种,石见穿的有效化合物2种,与泽漆汤质谱鉴定结果大体一致。筛选出肺癌与泽漆汤的共同靶点有59个,构建的蛋白互作网络图显示EGFR、AKT1、ESR1、KDR、PIK3R1和Cobimetinib体内MMP2等是其关键蛋白,与之相关的信号通路有PI3K-Akt和EGFR等通路。RNA测序结果共检测到表达基因共39479个,表达转录本共204245个,其中已知转录本179058个;H1299、H1650和A549三组差异基因分别为189、137和384个。KEGG分析与之相关的通路是复制与修复、细胞增殖与死亡、内分泌系统与癌症;GO分析显示细胞进程,细胞部分和结合是其主要功能。qPCR实验结果显示经过泽漆汤处理后,GPX4基因的DNA表达水平在非小细胞肺癌细胞株H1299、H1650和A549中下调;ACSL4基因的DNA表达水平在非小细胞肺癌细胞株H1299、H1650和A549中上调,且具有统计学意义。WB实验结果显示经过泽漆汤处理后,H1299和A549细胞中CCND1、CDC45、MMP2、MMP9、PTGS2、GPX4和SLC7A11蛋白的表达水平显著下调,且具有统计学意义。结论:1.泽漆汤主要是由黄酮、酚酸类、生物碱、萜类等一类物质组成,浓度较高的是短叶苏木酚酸、没食子酸、黄芩苷等具有抗癌功效的物质。2.泽漆汤能够有效histones epigenetics抑制非小细胞肺癌的发生发展,抑制H1299、H1650和A549三株非小细胞肺癌细胞株的增殖、迁移,阻滞细胞周期,促进细胞衰老和铁死亡过程,并呈现剂量依赖性。3.网络药理学筛选靶点基因与RNA测序差异基因具有相似性,泽漆汤与非小细胞肺癌的蛋白互作网络显示其关键蛋白为EGFR、AKT1、ESR1、KDR、PIK3R1、MMP2等,对非小细胞肺癌产生作用可能是通过PI3K-Akt和EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance信号通路。qPCR结果显示泽漆汤促进了H1299、H1650和A549三株细胞的铁死亡。WB结果显示泽漆汤抑制了非小细胞肺癌细胞的迁移,阻滞细胞周期并且促进其铁死亡。泽漆汤调节了H1299、H1650和A549三株细胞的基因表达,主要体现在细胞生长与死亡,内分泌与癌症,DNA复制与修复等方面。