研究背景1,2-二氯乙烷(1,2-DCE)在工业上主要用于黏合剂、溶剂和氯代烃的生产,可经呼吸道吸收引起职业中毒;又因1,2-DCE在工业和农业中的广泛使用,使其常被引入到环境中,成为一种普遍存在的环境污染物;且室内空气1,2-DCE的污染源来自翻新住宅、家用和个人护理产品的使用。因此,1,2-DCE除了在工业场所,还成为了环境中常见的挥发性有机污染物。人类可通过吸入室内受污染的空气和饮用受污染的水而接触到1,2-DCE。接触过量高浓度的1,2selleck合成-DCE可导致动物和人类发生中毒性脑病。鉴于1,2-DCE的毒性、持久性和潜在的生物蓄积作用,人们越来越关注其有害健康影响。但1,2-DCE中毒发生发展快、死亡率高、发病机制未明,造成1,2-DCE中毒常出现漏诊或误诊,部分中毒病例未能得到及时诊断,其危害具有隐匿性。1,2-DCE引起的中毒性脑病包括脑水肿和中毒性脱髓鞘。我们前期研究发现水通道蛋白4(AQP4)表达水平的改变是1,2-DCE中毒性脑水肿发生发展的关键分子事件,然而1,2-DCE如何影响AQP4的表达,以及AQP4表达的改变引起的下游具体分子事件与1,2-DCE中毒性脑病结局的关系仍不清楚。研究目的:1.探明AQP4在1,2-DCE致中毒性脑病中的作用;2.阐明1,2-DCE致中毒性脑病中的AQP4上游的表观遗传调控机制;3.阐明1,2-DCE抑制星形胶质细胞的AQP4蛋白表达后引起的下游具体分子事件与大脑皮质中毒性脱髓鞘病理结局之间的关系及分子机制。研究方法:1.AQP4在1,2-DCE致中毒性脑病中的作用及机制研究:使用野生型小鼠(Wild-type,WT)和AQP4基因敲除小鼠(AQP4 knockout,AQP4-/-,AQP4-KO)小鼠,进行1,2-DCE的28天重复剂量全身动式吸入暴露(0、100、350和700 mg/m3),结合毒代动力学研究血液中1,2-DCE内暴露水平和检测染毒柜中1,2-DCE外暴露浓度进行暴露质量监控,应用旷场实验检测1,2-DCE对小鼠的神经行为学的影响,脑含水量检测、血脑屏障检查、苏木素-伊红(H&E)染色和劳克坚牢蓝(LFB)染色观察1,2-DCE暴露后小鼠的大脑病理学改变,明确AQP4在1,2-DCE致中毒性脑病中的作用。2.1,2-DCE致中毒性脑病中AQP4上游的表观遗传调控机制研究:在动物水平上,探讨小鼠在1,2-DCE的28天重复剂量全身动式吸入暴露后,大脑皮质miR-29b-3p与AQP4的表达水平及其与1,2-DCE引起的脑水肿的关系;在细胞水平上,对星形胶质细胞进行miR-29b-3p的过表达和敲减,阐明在1,2-DCE引起的脑水肿中,1,2-DCE通过miR-29b-3p对AQP4的调控机制。3.“星形-少突”胶质细胞间的相互作用在1,2-DCE致大脑皮质中毒性脱髓鞘中的作用及机制研究:WT和AQP4-KO小鼠在1,2-DCE的28天重复剂量全身动式吸入暴露后,取脑皮质组织进行label-free蛋白质组学分析和验证,结合体外星形胶质细胞和少突胶质细胞共培养方法,通过实时荧光定量、免疫蛋白印迹、免疫荧光等技术手段探明其中间关键分子改变情况,阐明1,2-DCE抑制星形胶质细胞的AQP4蛋白表达后引起的下游具体分子事件与大脑皮质中毒性脱髓鞘病理结局之间的关系,以及1,2-DCE致大脑中毒性脱髓鞘的分子机制。研究结果:1.AQP4在1,2-DCE致中毒性脑病中的作用及机制研究:1,2-DCE暴露和AQP4缺失均可诱导小鼠神经毒性,表现为血脑屏障通透性和脑含水量增加、脑皮质异常病理空泡化、大脑皮质脱髓鞘和动物神经行为学异常改变。多重回归统计分析了 1,2-DCE暴露和AQP4缺失的交互作用,结果显示1,2-DCE暴露因素对小鼠神经毒性的影响取决于基因型(即AQP4的有或无),表明AQP4在调节1,2-DCE引起的神经毒性中发挥核心作用。2.1,2-DCE致中毒性脑病中AQP4上游的表观遗传调控机制研究:在动物水平,在WT和AQP4-KO小鼠的大脑皮层中均观察到miR-29b-3p的表达随着1,2-DCE暴露剂量的升高而升高,且1,2-DCE暴露后引起的脑含水量水平的改变与miR-29b-3p的表达水平呈正相关,这提示miR-29b-3p在1,2-DCE致脑水肿中发挥正向调控作用的生物学功能。在WT小鼠中,1,2-DCE暴露后小鼠脑皮质miR-29b-3p的升高与Aqp4 mRNA的表达水平负相关。在细胞水平,SVG p12细胞中miR-29b-3p表达上调导致AQP4 mRNA和蛋白的表达水平下降,而抑制miR-29b-3p导致AQP4 mRNA和蛋白的表达水平升高。双荧光素酶报告实验证明AQP4是miR-29b-3p的靶点。3.“星形-少突”胶质细胞间的相互作用在1,2-DCE致大脑皮质中毒性脱髓鞘中的作用及机制研究:在动物水平,Label-freeselleck蛋白质组学方法检测并筛选小鼠大脑皮质中与1,2-DCE暴露和AQP4抑制相关的差异表达蛋白,结果显示髓鞘碱性蛋白(MBP)和酪氨酸蛋白激酶Fyn(FYN)在WT小鼠中呈剂量依赖性下调,在AQP4-KO小鼠中AQP4的缺失同样引起MBP和FYN的低表达。Western blot和免疫荧光分析证实,1,2-DCE暴露可下调野生型小鼠星形胶质细胞AQP4和少突胶质细胞MBP的表达水平;小鼠AQP4敲除也可导致大脑皮质的少突胶质细胞MBP表达水平下降。在细胞水平,通过1,2-DCE处理或AQP4敲除后的星形胶质细胞SVG p12与少突胶质细胞MO3.13共培养,证实了星形胶质细胞AQP4的下调可抑制少突Cytogenetic damage胶质细胞MBP的表达水平。我们还发现1,2-DCE通过抑制AQP4-FYN,导致其下游分子CD38的上调,降解星形胶质细胞NAD+,继而驱动星形胶质细胞主要以炎症和氧化应激的增加为特征的微环境变化,最终引起少突胶质细胞脱髓鞘。研究结论:1.1,2-DCE暴露通过抑制AQP4诱导小鼠中毒性脑病,表现为神经行为学的异常改变、血脑屏障破坏、脑水肿和脑皮质脱髓鞘的发生。2.1,2-DCE通过上调miR-29b-3p,靶向抑制AQP4的表达,引起中毒性脑水肿。3.1,2-DCE通过抑制星形胶质细胞AQP4-FYN,致其下游基因CD38高表达而降解NAD+,诱发星形胶质细胞发生神经炎症和氧化应激,改变“星形-少突”胶质细胞间的微环境,最终导致少突胶质细胞MBP下调而引起脱髓鞘。