纹枯病是水稻三大病害之一,在世界各产稻均有发生。水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn)腐生性强,其主要通过分泌胞壁降解酶和毒素破坏寄主细胞结构,从而杀死寄主细胞并获得自身生长发育所需要的养分,帮助其在寄主体内扩展。前人研究表明,水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白OsPGIP1(Polygalacturonase-inhibiting protein 1)可抑制纹枯病菌多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases,RsPGs)活性,过表达OsPGIP1可显著提高水稻对纹枯病的抗性,但有关该基因与RsPGs互作提高水稻抗纹枯病的分子机制还未有研究。为明确该基因在水稻抗纹枯病中的作用,通过真核表达、瞬时表达、定点突变、酵母双杂和缺失突变等技术,初步研究了 OsPGIP1与RsPG1互作及提高寄主抗性的分子机制,结果如下:将RsPG1基因构建至真核表达载体pPIC9K并转化毕赤酵母selleck HPLC(Pichia pastoris)GS115,经甲醇诱导后,第5天其发酵上清酶活性达388.79 U/mL。提取并纯化蛋白,大小约40kDa,与预测分子量大小一致。表达产物在50℃、pH4.0的条件下酶活性最高,甲醇、甲醛、乙醇、乙酸乙酯和丙酮等有机溶剂对RsPG1酶活性无显著SCH772984 IC50影响,短时间紫外照射对RsPG1酶活性亦无显著影响。同样构建OsPGIP1基因至真核表达载体,尽管能获得阳性转化子,但均未能分离出其表达产物,发酵上清、菌体破碎上清、菌体破碎沉淀亦均无对RsPG1活性的抑制作用。将OsPGIP1和RsPG1基因分别构建至瞬时表达载体pMD1-35S-GFP,并转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101。将含有目的基因的农CNS-active medications杆菌液注射至烟草叶片,注射带有RsPG1基因的瞬时表达载体的烟草可产生水渍状病斑,而共注射RsPG1和OsPGIP1基因瞬时表达载体的烟草无水渍状病斑,表明OsPGIP1基因在烟草中的瞬时表达产物对RsPG1的活性有抑制作用。为明确OsPGIP1与RsPG1的互作位点,通过同源建模与表面自由能分析,筛选出现频率在0.5以上的6个位点进行点突变,分别命名为D60A、Q77A、R175A、R204A、R227A和D269A。酵母双杂显示,野生型OsPGIP1及6个突变体均能与RsPG1互作,说明这些位点的单个突变不影响OsPGIP1与RsPG1的互作。将这6个突变体构建至瞬时表达载体,与带有RsPG1的瞬时表达载体共注射烟草叶片,同样能抑制RsPG1形成的水渍状病斑,说明这些位点与OsPGIP抑制RsPG1的活性无关。PGIP为细胞壁结合蛋白,为明确与OsPGIP1向胞外运输的关键区域,对其LRR区进行渐进式的片段缺失,发现载短LRR区的OsPGIP1Δ9～OsPGIP1Δ1-9对OsPGIP1向胞质外运输无影响。信号肽外泌试验表明,OsPGIP1的信号肽具有很强的外泌功能。这可能就是失去LRR区,但保留了 N端、C端和信号肽区域,OsPGIP1突变体能够运输到胞外的原因。