背景:胶质母细胞瘤(Gliomablastoma,GBM)是成人中最常见的原发性恶性脑肿瘤,具有侵袭性强、预后差、复发率高等特点,其五年生存率仅为5%。由于胶质母细胞瘤向周围组织浸润性弥漫性生长的生物学特性,目前采用最大程度手术切除并辅以放疗和口服替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)化疗的综合治疗方案,患者的中位生存时间也仅延长至16-18个月。TMZ为治疗GBM最有效的抗肿瘤活性的烷化剂。研究表明,不敏感的GBM细胞在长期应用TMZ后会逐渐产生耐药性,残留的耐药细胞是术后复发的关键原因。因此,探索针对浸润性GBM细胞并克服耐药性的有效治疗策略具有重要的理论价值和临床意义。铁死亡(Ferroptosis)是一种依赖铁离子参与,区别于细胞坏死、细胞凋亡、细胞自噬的新型细胞程序性死亡方式。越来越多的研究表明,溶质载体家族7成员11(Solute Carrier Family 7 Member 11,SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶 4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)等作为铁死亡的关键调节因子,在克服GBM细胞耐药及抑制GBM复发中发挥不可或缺的作用。爱拉斯汀(Erastin)是第一个被发现可通过胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白(the cystine/glutamate antiporter system,System Xc-)、电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)和肿瘤蛋白 p53(TP53)等选择性且有效地介导铁死亡的小分子诱导剂。这也表明Erastin作为新型放射增敏剂和化学增敏剂具有良好的应用前景。然而,Erastin在普通溶剂中极差的溶解性限制了其在GBM治疗中的有效应用。脂质体(Liposomes)作为一个纳米载体,它的膜结构主要由胆固醇和磷脂组成,具有封装不同理化性质药物的能力。甲基丙烯化明胶(GelMA)为双键改性明胶,是具有光敏性的生物材料。基于上述理念,我们为了成功实现药物递送并抑制术后胶质母细胞瘤复发,构建了一种3D打印光固化水凝胶(Hydrogel)作为药物库,用于递送含有TMZ和Erastin的RGD环状肽(cRGD)修饰的脂质体(T+E@LPs-cRGD+GelMA)。cRGD可以识别肿瘤细胞过表达的ανβ3整合素受体以实现靶向治疗胶质母细胞瘤策略。Erastin激活铁死亡并与TMZ协同对耐药的GBM细胞表现出显著的抗肿瘤效果。另外,GelMA-脂质体递药系统通过IFN/PD-L1信号通路调节肿瘤免疫微环境,抑制术后胶质母细胞瘤复发。方法:将氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG2000-cRGD和Erastin以一定比例溶解在氯仿中,蒸发成膜,加入替莫唑胺溶液,经超声和脂质体挤出仪处理形成脂质体制剂。将合成的脂质体与GelMA溶液以一定比例混合,经3D打印光固化形成GelMA-脂质体系统。我们通过诱导筛选建立TMZ耐药细胞系U251TR和LN229TR。通过CCK-8、EdU、流式细胞术、Transwell实验及细胞划痕实验检测了不同纳米制剂对胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。通过实时定量PCR(RT-qPCR)技术与Western Blot实验检测了铁死亡相关调控因子的表达量。通过谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSH)检测、活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测、JC-1探针检测线粒体膜电位变化等实验检测了铁死亡的典型特征变化。RNA-Seq测序揭示了递药系统(T+E@LPs-cRGD+GelMA)参与的潜在机制,确定了 GelMA-脂质体系统通过IFN/PD-L1通路参与了胶质母细胞瘤的免疫调节。此外,我们通过建立原位脑胶质瘤动物模型对GelMA-脂质体系统体内抗肿瘤效果进行评价。结果:(1)水凝胶-脂质体纳米制剂的表征通过粒径电位检测仪、透射电镜对纳米粒进行理化表征,显示TNirmatrelvir+E@LPs-cRGD具有良好的球形纳米形态,平均水合粒径为164±3.05nm,平均电位为21.24±1.27mV,在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)中 7 日内纳米粒径基本保持不变。傅里叶红外光谱表明脂质体成功载入水凝胶,T+E@LPs-cRGD+GelMA的总体平均杨氏模量约为500 kPa。(2)水凝胶-脂质体纳米制剂的释放与细胞摄取以U252TR、LN229TR、NHA细胞系为模型,通过细胞摄取实验证明cRGD介导的主动靶向显著提高了肿瘤细胞的药物摄取效率;将荧光染料Sulfo-Cyanine5.5(Cy5.5)装载入脂质体(LPs-cRGD+GelMA)可以在PBS中持续释放14天。动物活体成像观察荧光标记的Cy5.5@LPs-cRGD+GelMA在C57BL/6J小鼠颅内可以稳定存在14天。(3)T+E@LPs-cRGD+GelMA体外抗肿瘤效果评价通过EdU、流式细胞术、Transwell及细胞划痕实验证实T+E@LPs-cRGD+GelMA具有最佳降低细胞活力,诱导细胞凋亡,降低细胞迁移和侵袭能力。(4)T+E@LPs-cRGD+GelMA 诱导铁死亡T+E@LPs-cRGD+GelMA通过诱导铁死亡,显著降低GPX4、xCT、MGMT的表达水平;GSH水平下降;MDA及ROS水平升高;与T+E@LPs-cRGD+GelMA共孵育的U52lTR与LN229TR细胞电镜下可观察到其线粒体萎缩,线粒体嵴减少或消失。(5)T+E@LPs-cRGD+GelMA参与调控肿瘤免疫RNA-seq测序筛选具有差异表达基因主要富集在干扰素相关通路。进一步实验证实T+E@LPs-cRGD+GelMA可以通过降低干扰素-γ(Interferon gamma,IFN-γ)的表达水平来逆转细胞程序性死亡-配体1(Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)的表达水平从而抑制GBM细胞免疫逃逸。(6)T+E@LPs-cRGD+GelMA体内抗肿瘤药效评价采用原位脑肿瘤小鼠为动物模型,手术减瘤后颅内给予不同治疗组。通过动物活体实验、苏木精伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色、免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)染色等实验表明T+E@LPs-cRGD+GelMA组有显著肿瘤抑制作用并使小鼠生存时间延长。免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测PD-LI组织表达水平降低。结论:本研究构建了一种用于颅内植入的新型3D打印水凝胶-脂质体纳米递药系统(T+E@LPs-cRGD+GelMA),实现了两种药物(TMZ和Erastin)共递送,提出了靶向清除残存GBM细胞的治疗Biomolecules策略。课题从细Alpelisib体外胞水平、分子水平、动物组织水平论证了 T+E@LPs-cRGD+GelMA递药系统可以诱导铁死亡,调控IFN/PD-L1信号通路,克服肿瘤细胞耐药。阐明了该递送系统能够协同调控肿瘤免疫微环境,有效抑制胶质瘤复发转移的分子生物学和免疫学调控机制。