目的:通过对气阴两虚型类风湿关节炎患者的临床资料、中医证候特点及合并症的回顾性分析,探讨本证型与患者年龄、性别、病程、临床表现、疾病活动度、实验室指标、合并疾病等的相关关系,并与其他证型进行比较,为气阴两虚型Air medical transport类风湿关节炎的中医辨证治疗提供一定的循证医学证据;通过网络药理学方法,探讨益气养阴通络方治疗类风湿关节炎作用机制;通过应用动物实验的方法,评价益气养阴通络方治疗类风湿关节炎大鼠疗效,并基于TNF-α/MAPK/JNK信号通路探讨本方的作用机制。材料与方法:1.临床观察:收录2019.01-2021.06于辽宁中医药大学附属医院风湿科住院的类风湿关节炎患者共237例,主要观察项目为:⑴一般情况:性别、年龄、病程;⑵临床表现:关节症状:关节压痛数、关节肿胀数;全身症状:口眼干涩、神疲乏力、肌肉酸痛、腰膝酸软、气短咳嗽、消瘦、自汗、盗汗、寐差、夜尿多等;⑶实验室指标及相关检查:炎症指标(ESR,CRP)、免疫学指标(RF,CCP)、疾病活动度((DAS28评分);⑷合并疾病:骨质疏松症、骨性关节炎、肺间质改变、干燥综合征及2型糖尿病。应用SPSS 22.0统计学软件对各结果进行分析比较。2.网络药理学研究:通过中药系统药理学数据库(TCMSP)与分析平台和本草组鉴数据库(HERB),并结合文献筛选成分靶点,补充未检索到的化学成分并查找相应作用靶点,并应用Uniport数据库将靶点信息标准化,使用CytoscaKPT-330溶解度pe3.9.1软件构建”药物-活性成份-靶点”关系图,并根据网络拓扑参数筛选出中药治疗的重要活性成分。通过Gene Cards、TTD、OMIM、Pharm Gkb和Drug Bank数据库获得类风湿关节炎疾病的相关靶点基因,绘制韦恩图并获取益气养阴通络方与类风湿关节炎的共同靶点,通过String数据库将获得的共同靶点进行蛋白质相互作用网络分析,并根据网络拓扑参数获得益气养阴通络方治疗类风湿关节炎的核心靶点,通过对GO生物功能和KEGG信号通路富集分析的研究,筛选益气养阴通络方发挥治疗类风湿关节炎作用的相关信号通路。3.动物实验:制备类风湿关节炎CIA大鼠模型,选取50只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组(CON组),模型组(CIA组),益气养阴通络方组(TCM组),甲氨蝶呤组(MTX组)和益气养阴通络方汤剂加甲氨蝶呤组(TCM+MTX组),每组10只。持续给药8周后取血清及关节滑膜组织。观察大鼠一般状态、关节肿胀度和关节炎指数变化,制备大鼠关节病理切片并检测血清白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和白介素-17(IL-17)MDV3100作用水平评价大鼠关节炎症状态。运用Western blot和QPCR方法分别检测大鼠滑膜组织中TNF-a、MAPK、JNK、P-JNK蛋白表达情况以及TNF-a、MAPK、IL-1β、IL-6基因表达情况。结果:1临床研究结果:⑴气阴两虚型RA与性别、年龄关系不明显,而病程与气阴两虚型呈正相关,气阴两虚型患者较非气阴两虚型患者病程更长。⑵炎症指标(ESR,CRP)、免疫学指标(RF,CCP)与气阴两虚型RA的相关性不明显。⑶气阴两虚型RA与关节压痛数关系不明显,与关节肿胀数、疾病活动度呈负相关,气阴两虚型RA患者关节肿胀数、疾病活动度均低于非气阴两虚型。⑷气阴两虚型RA患者较非气阴两虚型患者更易伴发骨质疏松症、肺间质改变、干燥综合征,与骨性关节炎和2型糖尿病相关性不明显。⑸气阴两虚型较非气阴两虚型RA临床特点上更易出现口眼干涩、神疲乏力、肌肉酸痛、腰膝酸软、气短咳嗽、消瘦、自汗、盗汗、寐差、夜尿多症状。2.网络药理学研究结果:⑴益气养阴通络方治疗RA的”药物-活性成分-靶点”结果显示槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素等成分是益气养阴通络方治疗RA的主要活性成分⑵益气养阴通络方活性成分治疗RA所调控的靶点互作网络显示PTGS2、PTGS1、TNF、JUN、IL-6、MAPK1、IL-1β、AKT1等是该网络的关键靶点,其很可能在益气养阴通络方治疗RA的过程中发挥主要作用。⑶益气养阴通络方治疗RA的关键靶点GO功能富集显示,益气养阴通络方可能通过信号转导、细胞增殖的正调控、基因表达的正调控、凋亡过程的负调控、炎症反应、对脂多糖的反应等生物学过程来治疗RA,其靶点大部分在质膜、细胞液、细胞质、细胞外间隙、细胞表面、膜筏等处,具有酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白质结合、蛋白激酶活性、血红素结合、内肽酶活性等分子功能。KEGG结果表明益气养阴通络方通过干预癌症中的通路、脂质与动脉粥样硬化、在糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、细胞凋亡、TNF信号通路等信号通路,达到治疗RA的作用。3.动物实验研究结果⑴益气养阴通络方可以显著改善RA大鼠关节肿胀程度,并从HE染色可以观察出大鼠关节内部有效缓解炎性细胞浸润、滑膜组织增生、血管翳形成以及软骨组织破坏。并且与单独使用甲氨蝶呤药物相比,益气养阴通络方联合甲氨蝶呤作用效果更好。⑵通过ELISA检测的实验结果可知,益气养阴通络方可以降低RA大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-17表达,调节炎症因子水平,达到控制炎症的作用,并且与单独使用甲氨蝶呤药物相比,益气养阴通络方联合甲氨蝶呤作用效果更好。⑶从Western blot和Q-PCR检测的实验结果可知,本实验造模动物为RA大鼠模型,在靶蛋白分析相关结果中找到大量的MAPK相关蛋白,证明由于TNF-α/MAPK/JNK信号通路被激活引起炎症反应,形成类风湿关节炎。益气养阴通络方可以降低RA大鼠滑膜组织中的TNF-a、MAPK、JNK、P-JNK蛋白表达水平和TNF-a、MAPK、IL-1β、IL-6m RNA的表达水平,并且与单独使用甲氨蝶呤药物相比,益气养阴通络方联合甲氨蝶呤作用效果更好。证明益气养阴通络方可以通过TNF-α/MAPK/JNK信号通路,发挥治疗RA的作用。结论:1.气阴两虚型RA与性别、年龄、炎症指标(ESR,CRP)、免疫学指标(RF,CCP)、关节压痛数关系不明显,与病程呈正相关,与关节肿胀数、疾病活动度呈负相关,并且气阴两虚型RA患者较非气阴两虚型患者更易伴发骨质疏松症、肺间质改变、干燥综合征,与骨性关节炎和2型糖尿病相关性不明显。在临床症状方面,气阴两虚型RA较非气阴两虚型更易出现口眼干涩、神疲乏力、肌肉酸痛、腰膝酸软、气短咳嗽、消瘦、自汗、盗汗、寐差、夜尿多症状。2.采用网络药理学的方法与技术,预测出益气养阴通络方发挥作用的活性成分可能是槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、汉黄芩素等,其作用的靶点可能为PTGS2、PTGS1、TNF、JUN、IL-6、MAPK1、IL-1β、AKT1等,通过GO富集分析和KEGG通路分析发现,其作用的通路可能是通过调控癌症中的通路、脂质与动脉粥样硬化、在糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、细胞凋亡、TNF信号通路等多条途径,故益气养阴通络方治疗RA是通过多成分、多靶点、多通路实现。3.结合网络药理学结果,通过制备CIA大鼠模型,应用动物实验的方法对治疗RA作用机制进行最终验证。通过对组织、蛋白和基因表达等多层面的分析,表明了益气养阴通络方通过作用于TNF-α/MAPK/JNK信号通路,下调TNF-α/MAPK/JNK信号通路的活性,从而降低炎症因子,改善炎症反应,最终达到治疗RA的目的,且益气养阴通络方联合甲氨蝶呤治疗效果更好。