研究背景与目的:急性肺损伤(ALI)是一种由多因素引起的临床综合征,通常是由炎症诱发的进行性肺损伤,主要表现为弥漫性肺泡损伤、低氧血症和呼吸窘迫。ALI的死亡率高达30%-40%。ALI的发病机制复杂,目前尚未完全阐明,尽管当前ALI的治疗技术取得了长足进步,但临床除了基础支持治疗外,仍缺乏特效治疗手段和药物,其治疗仍是棘手问题。ALI的发生常伴随着强烈的炎症反应和氧化应激,大量炎性细胞被活化分泌各种炎性介质,破坏了肺泡-毛细血管内皮屏障结构的完整性,同时,诱导肺组织细胞线粒体损伤及功能障碍,导致大量活性氧(ROS)累积。当ROS超过机体抗氧化系统清除能力时,呈现氧化应激状态。研究表明潜在的抗炎和抗氧化途径可被内源性或外源性化合物调节,将为控制急性肺损伤的发生发展提供新的治疗方法。多项研究已明确,铁死亡与炎症和氧化应激MC3引起的疾病的发生发展密切相关。铁死亡是一种新型细胞死亡形式,区别于细胞凋亡和自噬等常见死亡模式,主要以铁依赖性的活性氧(ROS)积累、细胞抗氧化剂失活以及线粒体收缩为特征。研究表明,铁死亡也是ALI发病的重要原因。通过抑制铁死亡可降低炎症反应,从而减轻急性肺组织损伤,有望成为治疗ALI的潜在手段。槲皮素是一种常见的黄酮类化合物,存在于多种水果和蔬菜中,具有广泛的药理作用,传统上被认为是一种有效的抗氧化和抗炎的天然生物活性化合物。目前,槲皮素在动物模型中已被证实可有效缓解急性肺损伤。然而,铁死亡在槲皮素治疗脂多糖诱导急性肺损伤中的作用及机制尚不清楚。因此,本研究通过构建急性肺损伤细胞及动物模型,探讨槲皮素对急性肺损伤的保护效应,并阐明槲皮素通过调控铁死亡进而保护急性肺损伤的分子机制,以期为急性肺损伤的防治提供新的策略。材料与方法:1.槲皮素对脂多糖诱导急性肺损伤的保护作用细胞实验:不同剂量LPS(0、5、10、20μg/ml)处理Ⅱ型肺泡上皮细胞(AT2),构建急性细胞损伤模型。在处理6、12、24h后,通过CCK-8和LDH评价LPS对AT2细胞的损伤作用。为明确槲皮素在急性肺泡上皮细胞损伤中的作用,利用不同浓度的槲皮素(0、5、10、20μM)预处理AT2细胞,在预处理2h后,LPS诱导急性细胞损伤模型,通过CCK-8和LDH释放实验评价细胞受损情况,选取最佳给药浓度,ELISA检测细胞培养上清液中炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达水平,利用Ed U实验检测细胞增殖情况,流式细胞术评价细胞死亡情况。动物实验:采用不同浓度槲皮素(0、20、40、60mg/kg)灌胃预处理C57BL/6J小鼠,在槲皮素预处理1h后,气管滴注LPS(5mg/kg)诱导急性肺损伤小鼠模型,通过HE染色、病理评分以及检测肺泡灌洗液中炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达水平来评估小鼠肺部炎性浸润情况,通过肺组织湿/干比值评估肺组织水肿情况,通过检测肺泡灌洗液中细胞计数和总蛋白浓度以及肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性评估中性粒细胞浸润程度以及肺泡-毛细血管屏障完整性。2.铁死亡在槲皮素治疗急性肺损伤中的作用研究脂多糖诱导构建急性肺损伤细胞和动物模型,组织水平上检测谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和铁离子的浓度,采用Dihydroethidium(DHE)荧光染色评价槲皮素处理前后各组ROS释放情况,并通过免疫组化检测GPX4和4HNE的表达水平。此外,在细胞水平上,通过检测GSH、MDA和铁离子的表达水平评估铁死亡的发生情况,利用流式细胞术对ROS的累积情况进行检测,并分析槲皮素对GPX4和4HNE的表达影响,通过透射电镜检测细胞线粒体形态变化及其损伤情况。3.槲皮素调控SIRT1/NRF2/GPX4通路抑制铁死亡保护急性肺损伤的机制研究为了进一步探究槲皮素抑制铁死亡的具体机制,在细胞和动物水平,通过western blot检测了SIRT1、NRF2和GPX4的表达水平。槲皮素联合EX527(SIRT1的抑制剂,5mg/kg)预处理小鼠,将C57小鼠分为四组(对照组、LPS组、LPS+槲皮素组、LPS+槲皮素+EX527组)。收集各组肺组织及肺泡灌洗液用于后续实验。通过HE染色、炎性损伤评分以及肺泡灌洗液中总蛋白浓度和细胞数量评估肺组织损伤情况,计算肺湿/干重比评价肺水肿程度,通过试剂盒检测肺组织MPO活性和铁离子浓度,组织免疫荧光检测肺组织中ROS水平,western blot检测铁死亡相关蛋白的表达情况。购买si-SIRT1干扰序列,利用q RT-PCR和western blot实验筛选出最佳干扰序列。通过CCK-8实验和流式细胞术实验评估沉默SIRT1后铁死亡的发生情况,流式细胞术检测ROS水平,试剂盒检测细胞中脂质过氧产物MDA的水平和铁离子浓度,透射电镜检测线粒体损伤情况。结果:1.槲皮素对脂多糖诱导急性肺损伤的保护作用细胞水平上,肺泡上皮细胞经LPS(0、5、10、20μg/ml)处理6、12、24h后,CCK-8和LDH检测显示,LPS处理显著抑制细胞活性,LDH释放增加,且呈一定时间和剂量依赖。据上述实验结果,我们选择了LPS浓度为10μg/ml处理12h构建细胞模型用于后续实验。为了筛选槲皮素的有效浓度,将实验分为以下5组:对照组(生理盐水)、LPS组和LPS+槲皮素组(0、5、10、20μM)。CCK-8和LDH检测结果表明,10μM和20μM槲皮素的保护效果类似且两者间无显著差异,基于这些数据,我们选择浓度为10μM的槲皮素进行后续细胞实验。Ed U细胞增殖实验和流式细胞术检测结果表明槲皮素预处理促进了肺泡上皮细胞的增殖。此外,ELISA检测结果表明槲皮素显著抑制了促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)分泌水平。由此可知,槲皮素能够有效缓解脂多糖诱导的急性肺泡上皮细胞损伤。动物水平,成功构建ALI小鼠模型,在该模型上分别用不同浓度的槲皮素(0、20、40、60mg/kg)预处理。HE染色和肺损伤评分提示,槲皮素可以显著抑制LPS诱导产生的急性肺组织损伤和炎性细胞浸润。肺湿/干重比结果表明槲皮素(40、60mg/kg)有效的缓解了肺组织水肿。相比于LPS组,LPS+槲皮素组肺组织MPO活性明显下降,同时,肺泡灌洗液中细胞数量、总蛋白浓度和炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达水平也显著降低。另外,LPS+槲皮素(40mg/kg)和LPS+槲皮素(60mg/kg)两组比较,无显著差别,因此选择40mg/kg为槲皮素作用的最佳浓度,并用于后续实验。以上实验结果表明,槲皮素能有效改善急性肺损伤小鼠模型的病理损伤。2.铁死亡在槲皮素治疗急性肺损伤中的作用研究分别用LPS和槲皮素干预C57小鼠和AT2细胞,与对照组相比,LPS诱导后小鼠正常肺组织结构丢失,间质充血水肿,肺间隔增厚,肺泡腔中出现炎症细胞和红细胞,肺组织炎性损伤评分也明显升高,而槲皮素治疗则显著改善了上述病理现象。无hospital-acquired infection论是体内体外,槲皮素可明显改善LPS诱导氧化应激相关蛋白水平的变化。与对照组相比,LPS组铁死亡相关指标铁离子浓度、ROS、4HNE和MDA水平显著升高,GSH活性水平及GPX4的表达均明显降低,提示随着铁死亡水平升高,急性肺损伤加重,而槲皮素处理后则明显逆转了上述现象。同时,LPS处理下调小鼠肺组织中SIRT1、NRF2、GPX4蛋白表达,而槲皮素则消除了LPS对SIRT1/NRF2/GPX4信号通路相关蛋白的抑制作用。此外,槲皮素可有效缓解肺泡上皮细胞线粒体的损伤情况。由此可知,急性肺损伤发生过程中伴随着明显的铁死亡,且槲皮素能有效抑制铁死亡的发生。3.槲皮素调控SIRT1/NRF2/GPX4通路抑制铁死亡保护急性肺损伤的机制研究基于以上实验结果,细胞水平上,我们构建稳定沉默SIRT1的肺泡上皮细胞。与对照组相比,沉默SIRT1组的肺泡上皮细胞增殖能力减弱,且铁死亡相关指标铁离子浓度、ROS水平和MDA含量明显升高,线粒体嵴减少或消失。由此可知,SIRT1是槲皮素抑制铁死亡发挥其抗炎和抗氧化作用的关键作用靶点。随后,在急性肺损伤动物模型上,我们采用SIRT1抑制剂EX527处理小鼠,以进一步证实槲皮素调控铁死亡改善急性肺损伤的分子机制。与LPS+槲皮素组相比,EX527处理使肺组织结构病变更明显,肺间质增厚、肺泡有出血和炎性细胞浸润,肺损伤评分升高。另外,肺水肿指标BALF中总蛋白及肺W/D比和肺组织MPO活性明显升高。同时,铁死亡相关指标铁离子浓度、4HNE和ROS水平显著升高,GPX4蛋白表达明显降低,提示在体内槲皮素可通过调控SIRT1进而抑制铁死亡的发生,缓解炎性细胞浸润,改善急性肺损伤。结论:我们的研究表明,槲皮素能够通过减https://www.selleck.cn/products/Verteporfin(Visudyne).html轻脂多糖诱导的肺泡上皮细胞损伤,抑制炎症反应和氧化应激来实现对急性肺损伤小鼠的保护作用,其作用机理与上调SIRT1/NRF2/GPX4信号通路进而抑制铁死亡密切相关。槲皮素显著改善了肺组织病理变化,提高肺泡上皮细胞增殖能力,抑制促炎细胞因子释放和活性氧(ROS)的生成,有效地改善了脂多糖诱导的肺损伤。在机制上,槲皮素有效地上调SIRT1/NRF2/GPX4信号通路,体内体外选择性抑制SIRT1则显著逆转了槲皮素对脂多糖诱导急性肺损伤的保护作用。综上所述,槲皮素可通过上调SIRT1/NRF2/GPX4信号通路抑制脂多糖诱导铁死亡的发生,从而发挥保护急性肺损伤的作用。