【目的】黑素瘤具有高度恶性、进展迅速、早期转移、对放疗和化疗不敏感以及高死亡率等特点。转移性黑素瘤患者的生存率极低,深入研究黑素瘤转移的分子机制是提高疗效的关键。越来越多的证据表明,棕榈酸(palmitic acid,PA)参与肿瘤发生发展过程,而Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)在肿瘤信号转导过程中同样发挥重要作用。然而,在人和小鼠黑素瘤中,PA是否能介导TLR4以及下游信号未见相关报道。故本课题旨在研究PA是否激活TLR4介导其下游信号影响小鼠黑素瘤肺转移,为阐明高PA饮食促进肿瘤的发生发展提供科学依据,为后期临床治疗提供理论依据以及新的方向。【方法】1.随机将20只雄性C57BL/6小鼠(6 W龄)分为正常饮食组、高PA饮食组,饮食干预8 W后,检测小鼠血清胆regular medication固醇以及甘油三酯水平。尾静脉注射B16细胞,构建黑素瘤的肺转移模型。用HE染色检测肺转移灶的大小以及数量;用Western Blot检测肺转移灶组织的E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达情况,用Western Blot以及免疫荧光检测小鼠肺转移灶组织的TLR4、TRIF、Peli1和p NF-κB蛋白表达。2.选用人黑素瘤A375细胞、小鼠黑素瘤B16细胞进行CCK-8实验,筛选PA促进黑素瘤细胞增殖的最佳浓度(12.5μM、25μM和50μM)。用最佳PA(25μM)浓度作用A375及B16细胞,通过Transwell实验及Western Blot检测E-cadherin、MMCaptisol配制P2和Vimentin蛋白表达水平,评估细胞侵袭能力。使用Western Blot以及免疫荧光检测PA处理细胞后TLR4、TRIF、Peli1、p NF-κB蛋白表达。3.使用TAK-242(TLR4抑制剂)和/或PA处理细胞,采用CCK-8检测细胞增殖能力。Western Blot检测TAK-242处理细胞后对E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达的影响,用Western Blot以及免疫荧光检测TAK-242处理对TLR4、TRIF、Peli1、p NF-κB蛋白表达的影响。4.使用靶向Peli1的si-RNA和/或PA处理细胞,通过CCK-8检测细胞增殖能力,用Western Blot检测沉默Peli1对黑素瘤细胞的E-cadherin、MMP2和Vimentin蛋白表达影响,进一步通过Western Blot以及免疫荧光检测TLR4、TRIF、Peli1、p NF-κB蛋白的表达水平。【结果】1.与正常饮食组相比,高PA饮食组小鼠血清胆固醇水平升高了48%。高PA饮食组小鼠肺转移灶数量明显增多、体积明显增大,转移灶组织中TLR4、TRIF、Peli1和p P65蛋白的表达升高,同时E-cadherin表达下调,MMP2和Vimentin的表达上调。2.梯度浓度PA作用A375和B16细胞后,PA(25μM)具有最佳的促增殖效果,分别为46%(A375细胞)和20%(B16细胞)。PA(25μM)作用A375和B16细胞后,A375和B16细胞的侵袭能力分别提升了58%和54%,同时E-cadherin表达下调、MMP2和Vimentin的表达上调,并伴随着TLR4、TRIF、Peli1、p P65蛋白的表达上调。3.TAK-242(TLR4抑制剂)剂量依赖性地抑制了A375细胞和B16细胞的增殖,最佳抑制浓度为50 n M,分别抑制了44%(A375细胞)和39%(B16细胞)。TAK-242(50 n M)单独作用A375和B16细胞后,E-cadherin的表达上调,Vimentin、MMP2的表达下调,以及TRIF、Peli1、p P65蛋白的表达下调。此外,TAK-242(50 n M)也可显著减少PA(25μM)诱导的细胞增殖,不同程度逆转了MMP2、Vimentin、TRIF、Peli1、p P65的高表达以及E-cadherin的低表达。4.3条靶向Peli1的si-RNA作用A375和B16细胞24h后,序列1号具有最佳的沉默效果,分别为65%(A375细胞)和45%(B16细胞)。si-RNA(序列1号)单独作用A375和B16细胞后,细胞增殖减少、E-cadherin表达上调,Vimentin、MMP2以及p P65蛋白的表达下调,而TLR4和TRIF表达不变。此外,si-RNA(序列1号)也可显著减轻PA(25μM)诱导的细胞增殖,不同程度逆转了MMP2、Vimentin和p P65高表达以及E-cadherin低表达,但不能逆转TLR4和TRIF的高表达。【结论】PA通过激活TLR4/TRIF-Peli1-p P65信号通路从而促进小鼠黑素瘤肺转移以及黑素瘤细胞的增殖以Gefitinib及侵袭。