目的:本研究通过对包括本实验室分离得到的柯萨奇病毒A组10型(Coxsackivirus A10,CV-A10)在内的我国CV-A10 VP1基因特征进行分析,了解国内CV-A10的变异变迁规律;挑选出分离自重症患者且为我国主要流行基因型的P148病毒株作为CV-A10代表毒株,分别对其VP1区、P1区、P2区和P3区进行基因重组分析,进一步探索国内CV-A10的流行病学特征;通过转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)技术了解CV-A10代表毒株P148感染人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞的差异表达基因谱,探索CV-A10的感染致病机制,为CV-A10的诊疗、防控工作提供基础数据。方法:1.对实验室从临床分离得到的11株CV-A10病毒分离株进行VP1全长扩增和序列测定,与Gen Bank中检索到的世界范围内具有代表性的CV-A10病毒分离株进行同源性分析。2.根据同源性分析结果,挑选CV-A10的代表毒株,对其基因全长进行扩增和序列测定。分别基于VP1区、P1区、P2区和P3区的序列信息与肠道病毒A组原型株和Blast后亲缘关系近的序列构建系统发育进化树。3.将CV-A10代表毒株P148以感染复数(Multiplicity oorganismal biologyf infection,MOI)为0.1的剂量感染生长状态良好的RD细胞,设计不同感染时间,然后利用TCID_(50)方法检测不同时间点细胞培养上清液中病毒滴度,进而确定CV-A10感染RD细胞的最适时间,构建CV-A10感染R寻找更多D细胞的细胞模型。4.在最适感染时间点分别收集感染组和对照组的细胞样品,利用试剂盒提取细胞总RNA,并检测其纯度和浓AZD9291配制度,然后送至公司进行高通量测序,得到不同处理条件下RD细胞的转录本信息,再通过生物信息学分析筛选出差异表达基因。最后,基于差异表达基因进行GO(Gene ontology)功能注释和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析,探索CV-A10的感染致病机制。结果:1.实验室自2009～2013年分离得到的11株CV-A10分离株之间VP1区的核苷酸序列同源性为94.9%～100%,氨基酸序列同源性为98.3%～100%。基于实验室保存的11条CV-A10分离株和从Gen Bank检索到的世界范围内具有代表性的54条CV-A10分离株的VP1区全长序列构建系统发育进化树。沿用国际惯用的肠道病毒基因型分型标准,基于VP1全长序列的核苷酸同源性,将65株CV-A10分离株分别划分至A、B、C、D、E、G等六个基因型。发现2009年以后,国内主要流行基因型为C基因型,且本研究的11株CV-A10分离株均属于C基因型。C基因型的组内核苷酸平均遗传距离为5.09%,和其他基因型的组间核苷酸平均遗传距离为16.41%～29.06%。2.挑选分离自重症患者的P148分离株作为CV-A10的代表毒株,对其基因全长进行扩增和序列测定。拼接后的P148分离株全基因序列总长为7411 bp,G+C%含量为47.73%。分别基于P148分离株的VP1区、P1区、P2区、P3区序列信息与肠道病毒A组原型株和Blast后亲缘关系近的毒株信息构建系统进化发育树。发现P148分离株的P2区与2009年来自山东的CV-A5分离株(Gen Bank:HQ728261)处于同一进化分支上,核苷酸同源性为66.0%。P148分离株的P3区与2016年来自湖南(Gen Bank:MK391073)和山东(Gen Bank:MH086032)的CV-A4分离株亲缘性较近,核苷酸同源性分别为86.2%和86.3%。提示P148分离株的P2区可能与CV-A5存在重组关系;在P3区可能与CV-A4发生了重组。但具体的重组时间和关系还有待进一步验证。3.将CV-A10代表毒株以MOI为0.1的剂量感染生长状态良好的RD细胞后,通过检测多个时间点细胞上清液的TCID_(50)发现,在CV-A10分离株P148感染RD细胞后的12 h和24 h,细胞上清液中的病毒滴度达到一个较高的水平,因此确定CV-A10分离株P148以MOI为0.1的剂量感染RD细胞的最适感染时间为12 h和24 h。4.通过RNA-Seq技术对CV-A10分离株P148感染12 h和24 h的RD细胞进行转录组分析,并与对照组(相同时间点未感染RD细胞)对比,分别筛选出2610个和2766个差异表达基因,韦恩图分析发现感染RD细胞12 h和24 h的差异基因集里面有603个重叠基因。进一步对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,我们发现在CV-A10感染RD细胞12 h后,差异表达基因主要在308条信号通路中富集;在CV-A10感染RD细胞24h后,差异表达基因主要在301条信号通路中富集。在CV-A10感染RD细胞的过程中,富集程度比较显著的关键通路大多与信号转导、抗病毒免疫、细胞周期、细胞凋亡、自噬等过程相关,如m TOR信号通路、IL-17信号通路、Wnt信号通路等。随后,我们以GADPH作为内参基因,对随机挑选的8个差异表达基因进行RT-q PCR验证,结果显示差异表达基因的变化趋势与RNA-Seq结果一致。结论:1.2009年以后,国内CV-A10主要流行基因型是C基因型。本研究的11株CV-A10临床分离株均属于C基因型,符合国内CV-A10流行趋势,可以作为国内CV-A10代表毒株。2.CV-A10代表毒株P148的P2区可能与CV-A5存在重组关系;在P3区可能与CV-A4发生重组。CV-A10的型间重组现象可能是其在国内手足口病病原谱中比例上升的重要原因。3.CV-A10感染RD细胞的过程中,IL-17信号通路、m TOR信号通路和Wnt信号通路等多个关键通路富集程度比较显著,提示RD细胞可能通过免疫调节、自噬、泛素系统降解蛋白等多种方式抵抗CV-A10感染。CV-A10可能通过上调PIM1表达水平、抑制IFN产生等多种途径实现免疫逃逸。