研究背景:脓毒症相关性脑病(SAE)是ICU中最常见的一种脑病,它是指机体受到各种感染而出现的炎症反应所导致的弥漫性脑功能障碍,没有明显的中枢神经系统(CNS)感染,主要表现意识水平紊乱和认知功能障碍。虽然近年来针对SAE的诊治有了很大进展,但是该病的发病率每年都在上升,死亡率也很高,对公共卫生造成了很大的影响。SAE的病因比较复杂,包括神经炎症、氧化应激、线粒体功能障碍、血脑屏障(BBB)损害、脑代谢及灌注改变、神经递质异常等。SAE涉及多种病理生理机制,其中,神经炎症是SAE继发神经功能障碍的重要致伤环节,目前尚缺乏有针对性的治疗和预防手段。腺苷能系统作为能量网络的稳态调节器,在调节免疫功能方面发挥着重要作用,包括大脑中涉及细胞因子的炎症过程。在应激条件下,腺苷水平会升高,并通过与G-偶联受体的相互作用在组织中发挥作用。近年来,研究表明,对腺苷代谢的研究似乎在治疗脓毒症方面具有广阔的前景。枸橼酸咖啡因是甲基黄嘌呤类药物的一种,众所周知,咖啡因是非选择性腺苷受体拮抗剂,可作用于不同的生物系统,特别是中枢神经,主要是通过刺激中枢神经系统而发挥作用。有研究显示其对不同的脑部疾病均有治疗作用,例如在高氧血症所致新生儿脑损伤中显示出抗氧化应激、抗炎和抗凋亡作用;可减少发育中大脑中的神经元由于缺血缺氧导致的凋亡;在神经退行性疾病模型中显示出改善脓毒症大鼠的认知障碍及行为异常,缓解认知障碍的作用。咖啡因通过调节腺苷受体缓解各种脑部疾病的严重程度,但其在SAE中的作用尚不明确,我们将探索枸橼酸咖啡因是否可通过抑制星形胶质细胞中UCP2/NLRP3轴减轻脓毒症相关性脑病所致神经损伤。目的:通过前瞻性研究收集SAE患者及对照组患者的脑脊液标本进行临床实验,以初步探索脓毒症相关性脑病的发病机制,探索NLRP3炎症小体激活和相关炎症因子是否可能参与SAE的发病。构建脓毒症相关性脑病大鼠模型,探索枸橼酸咖啡因是否可通过抑制星形胶质细胞中UCP2/NLRP3轴而减轻SAE所致神经损伤。探索枸橼酸咖啡因在脓毒症所致大鼠神经损伤中的保护作用,抗炎及抗凋亡特性,为有效防治SAE开辟新途径。研究方法1.临床实验:收集13例脓毒症相关性脑病儿童及13例对照组儿童(符合以下标准的神经系统疾病儿童作为对照:无任何神经炎症或神经退行性疾病,无脓毒症和脑病,磁共振成像无脑损伤,脑脊液分析无中枢神经系统感染)的脑脊液(CSF)剩余标本,-80℃保存。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定CSF中IL-18和IL-1β的水平。2.动物实验:选用60只日龄30天的健康雄性Wistar大鼠(体重100~120克),分为两组:(1)sham组;(2)SAE组。以盲肠结扎穿孔法(CLP)建立大鼠脓毒症模型。假手术的大鼠使用相同的方法分离盲肠,但没有结扎和穿刺。CLP处理12h后,进行神经行为学评分,筛选出SAE大鼠,SAE组按照用药与否以及剂量不同再分为三组:(1)SAE;(2)SAE+Caf(10mg/kg);(3)SAE+Caf(20mg/kg)。对10和20mg/kg咖啡因组大鼠进行枸橼酸咖啡因(Caf)给药,腹腔注射Caf,每天一次,连续三天。假手术组和SAE组大鼠腹腔注射等量生理盐水。最后一次给药后,处死各组大鼠,取每组大鼠脑组织部分用液氮冻存转移至-70℃超低温冰selleck抑制剂箱保存,部分用4%多聚甲醛固定,用于后续实验。利用Tunel-Neun免疫荧光双染,观察各组大鼠大脑皮层中神经元的凋亡,并对双阳百分比进行量化。GFAP是星形胶质细胞活化的标志物,利用GFAP免疫荧光染色检测各组动物大脑皮层中星形胶质细胞激活。利用试剂盒检测各组动物大脑皮层的线粒体膜电位(MMP),试剂盒检测各组动物大脑皮层中ROS生成。利用GFAP-UCP2免疫荧光双染,观察各组大脑皮层内星形胶质细胞中UCP2表达,并对双阳百分比进行量化。同时应用Western blot测定各组大鼠大脑皮层中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β蛋白的表达水平。3.细胞实验:分离Wistar大鼠大脑皮层星形胶质细胞,采用GFAP免疫荧光染色法进行鉴定。LPS(100ng/ml)联合IFN-γ(200U/ml)刺激星形胶质细胞24小时,建立星形胶质细胞脓毒症模型进行下一步研究。LPS及IFN-γ刺激同时,用100μM或200μM枸橼酸咖啡因处理细胞,分成四组:(1)control;(2)LPS+IFN-γ;(3)LPS+IFN-γ+Caf(100μM);(4)LPS+IFN-γ+Caf(200μM)。各组细胞中UCP2的蛋白水平、线粒体膜电位(MMP)、线粒体复合物Complex I和III的活性、ROS生成分tumour biology别采用Western blot、流式细胞检测术、试剂盒以及荧光染色进行检测。同样应用Western blot检测各组细胞中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β的蛋白水平,ELISA检测各组细胞上清中IL-1β、IL-18的含量。结果1.与对照组相比,SAE患者组脑脊液中IL-18和IL-1β水平显著上调(P<0.01)。2.CLP处理12h后,为了确认大鼠在CLP后12小时是否发生SAE,对大鼠进行神经行为测定。神经行为测试总分较低的CLP大鼠将被诊断为SAE。结果显示,SAE组的神经行为测试得分明Puromycin作用显低于假手术组,提示SAE大鼠模型制作成功。3.各组大脑皮层中神经元的凋亡情况显示,与Sham组比较,SAE组双阳百分比显著升高(P<0.01);与SAE组比较,SAE+Caf(10mg/kg)组和SAE+Caf(20mg/kg)组双阳百分比均显著下降(P<0.01),其中SAE+Caf(20mg/kg)组下降更明显,提示SAE组的大脑皮层中TUNEL/Neu N阳性细胞水平较高,枸橼酸咖啡因处理后,细胞凋亡受到限制。检测各组动物大脑皮层中星形胶质细胞激活情况,结果显示,与Sham组比较,SAE组GFAP蛋白阳性表达水平明显增多;与SAE组比较,SAE+Caf(10mg/kg)组和SAE+Caf(20mg/kg)组GFAP蛋白阳性表达水平有所减少(P<0.01),其中SAE+Caf(20mg/kg)组减少的更明显。GFAP荧光强度在CLP大鼠中显著增加,而枸橼酸咖啡因降低了GFAP的表达。这些结果表明,枸橼酸咖啡因可能抑制CLP诱导的神经元凋亡和星形胶质细胞的活化。4.与Sham组比较,SAE组的线粒体膜电位明显降低(P<0.01);与SAE组比较,SAE+Caf组(20mg/kg)的线粒体膜电位明显升高(P<0.01),提示枸橼酸咖啡因治疗恢复了线粒体膜电位水平,抵消了CLP的影响。与Sham组比较,SAE组ROS生成量明显增多(P<0.01);与SAE组比较,SAE+Caf(20mg/kg)组ROS生成量明显降低(P<0.01),提示CLP诱导的ROS水平的增加被枸橼酸咖啡因所抑制,表明线粒体功能恢复。这些数据表明,枸橼酸咖啡因可以保护线粒体功能免受SAE损伤。5.观察各组大脑皮层内星形胶质细胞中UCP2表达情况,结果显示,与Sham组比较,SAE组UCP2阳性蛋白表达水平有所降低,而GFAP阳性蛋白表达水平有所增加;与SAE组比较,SAE+Caf(20mg/kg)组UCP2阳性蛋白表达水平有所增加,而GFAP阳性蛋白表达水平有所降低,提示枸橼酸咖啡因处理诱导了UCP2蛋白表达的显著增加。与Sham组比较,SAE组中NLRP3蛋白、caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β的相对表达水平均显著增加(P<0.01);SAE+Caf(10mg/kg)组pro-IL-1β、IL-1β和NLRP3蛋白相对表达水平较SAE组显著降低,caspase-1蛋白相对表达水平有降低趋势但没有统计学意义;SAE+Caf(20mg/kg)组中caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β和NLRP3蛋白的相对表达水量均低于SAE组(P<0.01)。上述数据表明,枸橼酸咖啡因可以促进UCP2的表达,并抑制NLRP3炎症小体的激活。6.成功原代分离出大鼠大脑皮层星形胶质细胞。LPS+IFN-γ组UCP2蛋白相对表达量较Control组有上升趋势,但无统计学意义(P>0.05);与LPS+IFN-γ组比较,LPS+IFN-γ+Caf(100μM)组和LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组UCP2蛋白相对表达水平明显增加(P<0.01),其中LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组变化最大。LPS+IFN-γ组线粒体膜电位明显高于Control组(P<0.01);与LPS+IFN-γ组比较,LPS+IFN-γ+Caf(100μM)组和LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组线粒体膜电位明显降低(P<0.01),其中LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组变化最大,提示枸橼酸咖啡因显著恢复了MMP水平。LPS+IFN-γ组线粒体复合物Complex I、III活性均低于Control组(P<0.01);与LPS+IFN-γ组比较,LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组线粒体复合物Complex I、III活性均明显增加(P<0.01)。LPS+IFN-γ组ROS生成量较对照组明显增多(P<0.01);LPS+IFN-γ+Caf(100μM)组和LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组ROS生成量较LPS+IFN-γ组减少(P<0.01),其中LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组变化最大。以上数据表明,枸橼酸咖啡因可以促进UCP2的表达,缓解星形胶质细胞的线粒体功能障碍。7.与Control组比较,LPS+IFN-γ组中NLRP3、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β蛋白的相对表达水平均明显升高(P<0.01);LPS+IFN-γ+Caf(100μM)组和LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组的NLRP3、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β蛋白的相对表达水平明显比LPS+IFN-γ组低,其中LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组变化最为显著(P<0.01)。LPS+IFN-γ组细胞上清中IL-1β、IL-18含量明显高于Control组(P<0.01);与LPS+IFN-γ组比较,LPS+IFN-γ+Caf(100μM)组和LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组细胞上清中IL-1β、IL-18含量明显降低,以LPS+IFN-γ+Caf(200μM)组变化最为显著(P<0.01)。上述数据表明,与大鼠大脑皮层的结果类似,枸橼酸咖啡因抑制了星形胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活和促炎因子的分泌。结论1.通过前瞻性研究收集了SAE及对照组患者脑脊液标本进行实验,结果显示SAE患者组脑脊液中IL-18和IL-1β分泌显著增加,推测NLRP3炎症小体激活及相关炎症因子可能参与SAE发病机制,这些发现提示NLRP3炎性小体可能作为SAE的治疗靶点,需要进行进一步实验验证。2.通过盲肠穿刺结扎法成功建立了脓毒症大鼠模型,并通过神经行为测试可筛选出SAE大鼠模型。枸橼酸咖啡因可抑制SAE大鼠大脑皮层的神经元凋亡和星形胶质细胞活化,可缓解SAE大鼠大脑皮层线粒体功能障碍。枸橼酸咖啡因可以促进SAE大鼠大脑皮层星形胶质细胞中UCP2的表达,并抑制NLRP3炎症小体的激活。3.枸橼酸咖啡因可通过促进UCP2的表达,缓解LPS和IFN-γ刺激的星形胶质细胞的线粒体功能障碍;枸橼酸咖啡因可抑制LPS+IFN-γ刺激的星形胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活和促炎因子的分泌,从而起到对SAE的神经保护作用。综上所述,枸橼酸咖啡因通过激活UCP2的表达,从而抑制星形胶质细胞中NLRP3炎性小体的激活,减轻星形胶质细胞的线粒体功能障碍、星形胶质细胞激活和神经元凋亡,对SAE起到保护作用。我们的结果表明UCP2可能是使用枸橼酸咖啡因治疗SAE的治疗靶点。