柑橘(Citrus)作为我国重要经济作物之一,是我国栽种面积最广、经济价值最高的果树之一,枳橙(Citrange)作为柑橘最主要的砧木,而砧木氮素利用率不足制约了其生长,从而影响柑橘产量,因此研究柑橘砧木对氮素的吸收和利用是有必要的。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthase,GS)作为调控氮代谢的关键酶,在细胞中促进合成蛋白质和运输氮。为研究枳橙谷氨酰胺合成酶基因调控氮素代谢的特性和功能,本研究克隆了 GS基因家族中GInHZ的全长序列,并进行生物信息学分析,构建超表达载体并通过农杆菌介导法将基因转入拟南芥中,通过测定转基因型株系与野生型株系的表型、叶绿素含量、GS酶活等指标,对GInHZ基因功能进行分析讨论。1.从枳橙中克隆得到一个GlnHZ基因并开展生物信息学分析。结果表明:GlnHZ全长编码序列(coding sequence,CDS)为2523bp,编码确认细节840个氨基酸,分子式为C_(4211)H_(6617)N_(1119)O_(1233)S_(27),分子质量为93.51kD,等电点为5.78,不稳定系数为44.54属于不稳定亲水蛋白,GlnHZ蛋白中信号肽存在概率为0.0004,蛋白二级结构结果表明含有394个α-螺旋(α-spiral),占比为46.9%。1 14个伸展链(Extended strand),占比为 13.57%。β-转角(β-turn)44个,占比为 5.24%。无规则卷曲(Random coil)288个,占比为34.29%。预测没有任何跨细胞膜结构,无信号肽,为非分泌蛋白。亚细胞定位预测在叶绿体、细胞核、细胞质、液泡和细胞骨架中均有存在。进化树分析表明GlnHZ蛋白与克莱门柚(Citrus clementina)和甜橙的亲缘关系最相近为90%,与文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)也存在着62%的同源关系。2.利用同源重组技术成功构建了 PBI121-GInHZ超表达载体。提取质粒扩繁线性化后与目的基因进行重组,连接转化DH5α大肠杆菌培养,挑菌检测并完成测序,利用冻融法转化农杆菌GV3101,花序侵染法侵染野生拟南芥获得转基因植株,在含有卡那霉素抗性的培养基中筛选出了阳性植株并selleck NMR提取DNA进行PCR检测,获得T1、T2代植株种子。3.将T2代转基因型与普通野生型拟南芥,用Hoagland营养液进行培养。在培养的15d-45d期间分别测定其株高、抽薹时长和抽薹根数、根系结构扫描、生物量、叶绿素含量及GS酶活等指标。结果表明:转基因株系在几次测定时,株高均要高于野生型,抽薹时间也早于野生型3-5d,抽薹根数平均多约一根。转基因株系的根系在根长度、根表面积和侧根数上均强于野生株系。转基因株系生物量在25d时低于野生型株系,但在45d时二者无显著差异;转基因型株系绿素a、叶绿素b和总叶绿素均显著高于野生型株系;GS酶活表现出转基因型株系显著高于野生型,且随着栽培时间的增加,转基因型GS酶活的下clinical genetics降速率显著低于野生型。结论:试验结果表明GInHZ基因的过量表达促进了转基因植株的分根,从而提高拟南芥对氮素的吸收、进而促进地上部生长和增加叶绿素含量。因此推测GInHZ基因对拟南芥氮素吸收代谢有着正向调节作用。这一研究为后续柑橘氮素高效利用品种选育提供一定的理论基础。