3-羟基丁酮(Acetoin,AC)是微生物糖代谢途径的溢流代谢主要产物之一,具有3R-AC和3S-AC两种旋光异构体,并且在医药和化工合成方面具有很高的市场价值Others抑制剂和重要的工业意义。微生物发酵3-羟基丁酮过程中常常伴随有副产物2,3-丁二醇(Butanediol,BD)的生成。课题前期为了提高B.subtilis3-羟基丁酮的产量删除了其与2,3-丁二醇合成相关的丁二醇脱氢酶(Butanediol dehydrogenase,BDH)编码基因bdhA,但在bdhA缺失菌株中依然检测到内消旋丁二醇(meso-BD)的积累。同时,还发现bdhA缺失菌株产AC的两种旋光异构体比值发生较大变化,3S-AC量大幅减少。因此,本论文围绕B.subtilis发酵AC过程中meso-BD的来源以及3S-ACICI 46474的减少两方面入手,通过对菌株发酵行为分析、新的BDH基因的挖掘、验证,bdhA基因编码蛋白催化特性开展研究工作,主要研究结果如下:(1)通过文献挖掘和生物信息学分析在B.subtilis 168基因组中找到一条可能与meso-BD合成相关的目标序列(将其命名为bdhB),其在NCBI中的登录号为NP_389260.1,被注释为氧化还原酶,长度为747bp,与以Bacillus sp.101菌株中meso-BDH基因同源性为98%。该基因序列编码蛋白质理论分子量为26.2KDa,不存在跨膜区、信号肽,为非分泌蛋白。该序列中包含adh_short_C2结构域(Accession:PF13561)、细胞壁合成蛋白CwsA家族(PF10814)和短链脱氢酶结构域(Accession:c135484)。本文首先采用基因敲除方式验证bdhB基因的功能,但通过各种条件的转化尝试,始终没有获得bdhB基因敲除转化子。根据对基因氨基酸序列预测,推测该酶可能与细胞分裂和细胞形态维持有关,敲除该基因后可能会导致细胞死亡。因此,本文又采用qRT-PCR技术,通过分析了原始菌株和bdhA缺失菌株中bdhB基因的在不同发酵周期表达量差异,结合菌株发酵行为,发现在相同培养时间下,bdhA缺失菌株中bdhB基因的表达量与meso-BD产量呈正相关关系,初步判定bdhB基因与meso-BD合成有相关性。(2)成功构建了bdhA基因的枯草芽孢杆菌分泌型表达载体pHT43-bdhA和大肠杆菌的pET28a-bdhA、pGEX-bdhA表达载体。采用枯草芽孢杆菌pHT43-bdhA表达,采用硫酸铵沉淀等常规酶蛋白纯化方法,沉淀中没有检测到目标蛋白条带,分析原因可能是bdhA在枯草中表达量偏低。使用大肠杆菌pET28a表达载体表达(纯化标签为组氨酸标签(His-Tag)),蛋白纯化效果不理想。使用大肠杆菌pGEX-bdhA表达载体(纯化标签为GST标签),成功获得了 R-BDH蛋白。分别以3-羟基丁酮和2,3-丁二醇为底物检测了R-BDH的催化特性,结果表明R-BDH不仅能够催化3R-AC和(2R,3R)-2,3-BD之间相互转化,也能够催化3S-AC和meso-2,3-BD相互转化。(3)基于GenB ank、Brenda、Uniprot等数据库搜集了不同来源和底物特性的BDH序列,采用生物信息学手段比较了序列同源性及蛋白质结构。发现不同来源的R-BDH亲intermedia performance缘关系较近,而meso-BDH、S-BDH与DAR分类特征不明显,DAR也可能属于meso-BDH或S-BDH的一种。结构域分析显示R-BDH含有乙醇脱氢酶GroES样结构域和锌结合脱氢酶结构域,S-BDH、meso-BDH和DAR都有一个短链脱氢酶结构域、烯酰基-(酰基载体蛋白)还原酶结构域和一个酮基还原酶结构域。(4)基于对B.subtilis菌株168和168D的发酵产物中AC和BD不同旋光异构体含量变化以及其体内两种BDH催化特征,基本可以推定B.subtilis168发酵液中3S-AC是由3R-AC通过双酶(R-BDH和meso-BDH)催化转化而成。