衰老是一种不可抗拒的自然规律,人类生长发育到成熟期以后,随着年龄的增长,衰老细胞在各组织中积累,在形态结构和生理功能方面出现一系列的退行性变化。神经系统是最易受衰老影响的重要靶器官。研究显示,器官及细胞衰老具有不同步性,早衰鼠中星形胶质细胞早于神经元发生衰老,在寿命最长的人脑中,大约有30%的星形胶质细胞已经衰老,而在AD患者中衰老的星形胶质细胞高达40%以上。因此我们推测星形胶质细胞衰老可能在衰老向AD演变中发挥重要作用。衰老细胞能够积累并释放多种损伤相关分子DAMPs,直接激活炎症反应,或以旁分泌形式导致相邻细胞发生衰老。此外,DAMPs亦可通过释放进入细胞质及细胞外,在炎症反应、破坏神经元-神经胶质细胞相互作用所需的细胞-细胞接触以及加速神经退行性进程中扮演重要角色。因此提示衰老星形胶质细胞分泌的DAMPs是神经退行性疾病的重要贡献者,而线粒体作为星形胶质细胞生理功能的基础,线粒体功能失调被认为是衰老的标志之一。mtDNA是线粒体功能障碍时释放的重要因子。在线粒体功能障碍的衰老动物模型中,mtDNA稳定性被破坏,线粒体膜小孔开启,mtDNA释放进入细胞质及细胞外。研究显示,循环mtDNA随着年龄的增长而增加,伴有衰老细胞堆积,且与机体持续的慢性炎症反应程度呈正相关。另有研究表明衰老线粒体功能障碍释放的mtDNA与帕金森病的发生发展有关。而AD患者脑脊液中也发现了 mtDNA拷贝数含量的显著上升。因此,我们推测星形胶质细胞衰老释放mtDNA可能是衰老向AD转变的物质基础。此外,mtDNA在促进衰老向AD演变细胞互作的多维分子调控机制以及是否具有不同的靶细胞炎性信号通路倾向现象需要阐明。目前已发现线粒体功能障碍时,mtDNA释放至胞浆或胞外,被①TLR9、②cGAS 或③NLRP3 受体识别,激活 MyD88-NF-κB、STING-I-IFN 或 Caspase1 炎性信号通路,释放大量促炎因子,参与众多炎性相关疾病的发生和发展。小胶质细胞作为常驻中枢神经系统的主要免疫效应细胞,在AD的发生发展中发挥着神经保护和免疫损伤的双重作用。在衰老过程中,大脑中的细胞是否会对脑内游离mtDNA做出反应,参与脑衰老向AD演变,同时,脑内小胶质细胞或者神经元中的上述三条DNA识别途径是否都识别mtDNA从而发挥作用,尚不明确。基于以上背景,本论文研究内容分为以下三个部分。第一部分探讨星形胶质细胞衰老在脑衰老向认知功能障碍演变中的作用(1)年龄对小鼠认知功能的影响方法:为评价认知功能障碍与年龄之间的关系,研究构建了 4月龄、18月龄、26月龄三个不同的小鼠年龄节点分别用于模拟人类年轻、中年、老年三个时间段,通过水迷宫行为学实验检测小鼠认知功能障碍改变。结果:小鼠定位巡航及空间探索能力随着年龄增长不断下降,26月龄小鼠下降最为显著。该研究结果表明年龄相关认知功能障碍易在高龄小鼠中产生。(2)年龄对小鼠脑细胞衰老的影响方法:为了探究认知功能障碍出现的可能原因,研究通过对构建的自然衰老小鼠脑内的星形胶质细胞(GFAP+)和神经元(MAP2+、NEUN+)进行了与衰老标记物(P16INK4a+、P21WAF1+)共表达的免疫荧光双染实验以及神经元变性(HE、Nissl染色)、树突改变(MAP2+)、神经元退化水平(FJC染色)和突触前后膜功能蛋白(SYN+、PSD95+)的表达水平检测,同时,还对脑内的线粒体功能改变及氧化水平改变进行了检测,并采用电镜技术观察了不同月龄小鼠脑内星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元VX-445临床试验中线粒体结构的改变。此外,研究也对脑中小胶质细胞的激活(Iba1+)情况和炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达水平进行了检测。结果:①随着小鼠月龄的不断增高,海马区星形胶质细胞(GFAP+)激活增加,星形胶质细胞及神经元在18月龄时已广泛表达细胞衰老标记物P16INK4a和P21WAF1;②神经元衰老标记物P16INK4a在18月龄小鼠中同样广泛表达,但P21WAF1的表达在26月龄时仅在海马DG区被检测出;③神经元形态排列松散,数目减少,树突减少,突触前后膜功能蛋白(SYN、PSD95)表达水平下降并伴有神经元退化情况出现;④小鼠脑内海马区发现线粒体功能(膜电位、ATP)下降及氧化水平(MDA、蛋白羰基含量)增加,线粒体超微结构中发现星形胶质细胞线粒体嵴结构改变;⑤小胶质细胞被激活(Iba1+)并伴有海马区炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的释放增加。该研究结果表明随年龄增长,小鼠脑内星形胶质细胞线粒体结构异常并出现衰老表型,小胶质细胞被激活,神经元受损。(3)复制型衰老星形胶质细胞对小胶质细胞和神经元的影响方法:为了进一步探究衰老星形胶质细胞是否能够对小胶质细胞或神经元产生不利影响,建立了以连续传代方法诱导的复制型星形胶质细胞衰老模型,观察其与小胶质细胞和神经元之间的相互作用。通过检测复制型衰老星形胶质细胞中P53、P21、P16蛋白的表达变化以及衰老相关分泌表型IL-6的分泌量变化,同时检测细胞内线粒体膜电位、ATP、ROS改变,此外,MTT检测复制型星形胶质细胞衰老上清直接与神经元孵育,或与小胶质细胞孵育后间接作用神经元后神经元的增殖水平以及小胶质细胞上清液中炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的分泌变化。结果:①复制型星形胶质细胞表现出细胞衰老表型P53、P21、P16蛋白的表达增多,并伴有衰老相关分泌表型IL-6的分泌升高,同时线粒体膜电位和ATP下降,胞内ROS水平升高;②受衰老星形胶质细胞上清孵育的小胶质细胞上清液与神经元细胞共孵育后,小胶质细胞释放TNF-α、IL-6增多,神经元细胞存活率显著降低;③衰老星形胶质细胞上清孵育神经元后,神经元亦存活率下降。该研究结果说明复制型衰老星形胶质细胞在体外可以通过直接引起神经元损伤或通过激活小胶质细胞间接导致神经元损伤。(4)氧化型衰老星形胶质细胞对小胶质细胞和神经元的影响方法:为探究急性刺激下的应激性细胞衰老模型,从多种角度探讨不同条件下引起的细胞衰老对脑内其他细胞可能产生的影响,构建了 H2O2诱导的急性应激性细胞衰老模型。通过检测氧化型衰老星形胶质细胞中P53、P21、P16蛋白的表达变化以及衰老相关分泌表型IL-6的分泌量变化,同时检测细胞内线粒体膜电位、ATP、ROS改变,以及线粒体分裂融合(Drp1、Fis1,Opa1)蛋白表达变化。此外,MTT检测氧化型星形胶质细胞衰老上清直接孵育神经元,或通过小胶质细胞间接作用神经元后神经元的增殖水平以及小胶质细胞上清液中炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的分泌变化。结果:①氧化型星形胶质细胞衰老表型相关蛋白P53、P21、P16表达上升,且伴有衰老相关分泌表型IL-6的分泌升高,同时线粒体膜电位和ATP快速下降,胞内ROS水平显著上升,线粒体分裂蛋白Drp1表达增加;②氧化型衰老星形胶质细胞可以通过直接作用神经元或激活小胶质细胞分泌炎性因子(TNF-α、IL-6)间接作用神经元引起神经元存活率下降。该研究结果表明氧化型衰老星形胶质细胞引起神经元损伤亦可通过直接或小胶质细胞间接途径所导致。(5)衰老星形胶质细胞线粒体功能改善对神经元的保护作用研究方法:黄连素被证实能够保护线粒体并改善线粒体功能,因此我们将其作为线粒体保护剂对细胞衰老模型诱导前的星形胶质细胞进行了干预,检测其是否能够保护星形胶质细胞抵抗衰老,减少其直接或间接损伤神经元的能力。研究对黄连素干预保护线粒体后氧化型星形胶质细胞的衰老相关蛋白P53、P21、P16蛋白水平以及IL-6分泌量进行了检测,同时还检测了星形胶质细胞中线粒体膜电位和分裂融合蛋白(Drp1、Fis1、Opa1)的表达改变,此外,还对复制型和氧化型衰老星形胶质细胞上清与神经元直接或间接作用后对神经元中的线粒体膜电位、ATP、LDH分泌量以及神经元的退化水平和突触前后膜功能蛋白(SYN、PSD95)的表达情况进行了检测。结果:①黄连素能够下调氧化型星形胶质细胞衰老相关蛋白表达,改善线粒体膜电位水平及稳定线粒体分裂能力,降低Drp1的表达量;②黄连素能够改善复制型和氧化型衰老星形胶质细胞条件培养基对神经元线粒体膜电位、ATP引起的损伤,并显著下调神经元LDH分泌水平,改善神经元退化情况,增强神经元突触前后膜功能蛋白SYN和PSD95的表达水平。该研究结果表明黄连素能够减轻星形胶质细胞衰老表型,改善衰老星形胶质细胞线粒体功能,减弱神经元损伤,增强突触功能。第二部分探讨衰老星形胶质细胞释放mtDNA是脑衰老向认知功能障碍演变细胞互作的核心分子(1)衰老星形胶质细胞mtDNA外溢研究方法:研究利用dsDNA检测试剂盒对黄连素预保护后的两种不同星形胶质细胞衰老模型上清液中的dsDNA进行了检测,同时对不同年龄段小鼠脑脊液、脑细胞胞质内及血清中游离mtDNA进行了 Taqman探针法检测mtDNA拷贝数水平。结果:①复制型和氧化型衰老星形胶质细胞上清中游离mtDNA含量显著上升,黄连素能够通过保护线粒体从而减少mtDNA外溢出细胞;②随着年龄增长,小鼠脑脊液和海马区细胞细胞质中游离mtDNA显著升高,而血清中游离mtDNA随年龄增长显著下降。该研究结果表明随年龄增长,星形胶质细胞可能出现衰老并向胞外释放了 mtDNA。(2)mtDNA类似物侧脑室注射后对认知功能影响的研究方法:为了考察mtDNA是否引起了小鼠认知功能障碍产生,研究首先利用不同浓度mtDNA类似物对年轻小鼠进行了侧脑室注射。结果:①mtDNA类似物侧脑室注射后7天、14天、28天后Y迷宫行为学实验中的小鼠均出现了对新奇事物探索兴趣的下降;②水迷宫行为学实验显示出在mtDNA类似物注射14天、28天后小鼠认知功能出现障碍,且CpG-1826 20μg注射组认知功能障碍程度最为显著。该研究结果表明mtDNA类似物侧脑室注射能够引起年轻小鼠产生认知功能障碍。(3)mtDNA类似物侧脑室注射后小胶质细胞激活作用研究方法:为了验证mtDNA是否引起了小鼠脑内小胶质细胞激活和炎性因子的产生,研究对mtDNA类似物侧脑室注射后小鼠脑内小胶质细胞激活(Iba1+)程度,以及炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的表达水平进行了检测。结果:mtDNA类似物侧脑室注射14天、28天后能够显著增加小鼠脑内小胶质细胞激活数量,且激活程度和mtDNA类似物给药剂量呈正相关,同时,脑内炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达升高。该研究结果表明mtDNA类似物侧脑室注射能够引起小鼠脑内小胶质细胞激活,且激活程度与给药剂量呈正相关。(4)mtDNA类似物侧脑室注射后神经元损伤作用研究方法:为了探究mtDNA是否能够引起脑内神经元结构及功能改变,研究对mtDNA类似物侧脑室注射后的小鼠脑内神经元树突标记蛋白MAP2的表达量、突触前后膜功能蛋白(SYN、PSD95)的表达量进行了免疫组化分析,通过HE、Nissl染色观察神经元结构及数目改变,并通过高尔基银染检测分析了海马区神经元树突长度、数量、分支数及树突棘密度的改变情况。结果:①mtDNA类似物侧脑室注射28天后皮层及CA1区神经元树突标记物MAP2阳性表达显著下降,突触前后膜功能蛋白表达下降;②mtDNA侧脑室注射28天后海马区神经元树突长度、数量、分支数及树突棘密度显著下调,且下调程度随着给药剂量增加更为显著;③mtDNA类似物侧脑室注射14及28天后能够引起锥体神经元和颗粒神经元细胞胞质出现同自然衰老小鼠内相似的深染情况,但神经元的数目未发现有显著影响。该研究结果表明mtDNA类似物侧脑室注射28天后能够引起小鼠脑内神经元损伤,且损伤程度与mtDNA类似物给药量呈正相关。(5)星形胶质细胞衰老释放mtDNA引起神经元损伤方法:为了探究mtDNA是否能够通过直接或间接损伤神经元,研究对复制型和氧化型衰老星形胶质细胞上清与神经元直接或间接作用后对神经元中的线粒体膜电位、ATP、LDH分泌量以及神经元的退化水平和突触前后膜功能蛋白(SYN、PSD95)的表达情况进行了检测。结果:衰老星形胶质细胞上清液中的mtDNA能够直接或间接引起神经元膜电位和ATP的下降,同时引起LDH分泌量及神经元退化水平的上升,神经元突触功能蛋白的荧光表达强度下降,而在条件培养基作用前给予DNAse Ⅰ降解mtDNA后能够显著改善衰老星形胶质细胞条件培养基引起的神经元直接或间接损伤。该研究结果表明衰老星形胶质细胞释放的mtDNA能够通过直接或间接作用引起神经元损伤。第三部分mtDNA激活TLR9、cGAS、NLRP3炎性信号通路促神经元损伤(1)小胶质细胞及神经元内TLR9、cGAS、NLRP3炎性信号通路表达研究方法:本部分采用免疫荧光双染和蛋白表达实验对自然衰老小鼠、mtDNA类似物侧脑室注射小鼠脑中以及体外培养的小胶质细胞及神经元中mtDNA的主要识别受体TLR9、cGAS、NLRP3的表达情况进行了检测,探究mtDNA是否能引起小胶质细胞和神经元中三种DNA识别受体的激活,此外还检测了 mtDNA类似物体外作用神经元及小胶质细胞后细胞上清中促炎因子的分泌水平。结果:①自然衰老小鼠脑内小胶质细胞及神经元中TLR9、cGAS、NLRP3的表达量随年龄增长而显著升高;②mtDNA类似物侧脑室注射小鼠脑内小胶质细胞及神经元中TLR9、cGAS、NLRPCCRG 81045采购3的表达量随mtDNA类似物注射剂量的升高而增高;③体外mtDNA类似物干预神经元及小胶质细胞均能引起两类细胞中TLR9、cGAS、NLRP3通路蛋白的表达增加;④mtDNA类似物干预后小胶质细胞上清中TNF-α和IL-6分泌量升高,神经元细胞上清中IL-1β分泌量升高。该研究结果表明mtDNA能够激活小胶质细胞及神经元中TLR9、cGAS、NLRP3三类DNA识别受体的蛋白表达,并能引起促炎因子释放。(2)mtDNA通过激活TLR9、cGAS、NLRP3信号通路介导神经元细胞损伤方法:IL-1β的分泌量在衰老小鼠以及mtDNA类似物侧脑室注射小鼠脑中显著升高,而在体外衰老星形胶质细胞条件培养基作用后的Neuro-2a细胞培养时发现,部分Neuro-2a细胞胞体膨大,因此,衰老星形胶质细胞释放的mtDNA是否作为一种外源DAMPs介导了神经元细胞中焦亡程序的发生呢?本部分研究对复制型和氧化型衰老星形胶质细胞直接和间接作用神经元后神经元中的GSDMD剪切体的表达水平进行了检测,同时检测mtDNA类似物直接或间接作用神经元后神经元中的GSDMD剪切体的表达、以及神经元退化情况和突触功能蛋白的表达改变进一步验证衰老星形胶质细胞释放mtDNA介导神经元焦亡发生,引起神经元损伤。结果:①复制型和氧化型衰老星形胶质细胞上清与神经元孵育引起了神经元中GSDMD-N蛋白表达增高;②mtDNA类似物直接作用神经元也引起了神经元中GSDMD-N蛋白表达增高,同时神经元退化水平上升,突触功能蛋白表达下降;③衰老星形胶质细胞上清通过小胶质细胞和神经元间接作用后引起神经元中GSDMD-N蛋白表达增高;④mtDNA类似物通过小胶质细胞间接作用神经元同样引起了神经元中GSDMD-N蛋白表达增高,同时神经元退化水平上升,突触功能蛋白表达下降。该研究结果表明,mtDNA介导的TLR9、cGAS、NLRP3信号激活能够引起神经元焦亡发生,导致神经元退化及突触功能损伤。综上所述,本论文得出以下结论:(1)脑衰老向认知功能障碍演变时星形胶质细胞出现衰老,并产生线粒体功能障碍,导致线粒体内mtDNA进入细胞质或逃逸到细胞外;(2)mtDNA是脑衰老向认知功能障碍演变细胞互作的核心分子;(3)游离的mtDNA能够通过DNA模式识别受体(TLR9、cGAS、NLRP3)激活炎症信号通路,一方面激活小胶质细胞,放大炎症反应,加速神经元受损,另一方面直接作用神经Diagnostic biomarker元导致焦亡的发生。