目的胰腺癌是临床上常见的消化道肿瘤,具有恶性程度高、预后差的特点。5-氟尿嘧啶(5-FU)作为胰腺癌治疗的一线用药,在临床治疗中广泛应用。但由于5-FU本身具有半衰期短、口服吸收困难,毒副作用大,不良反应多等缺点,限制了患者对其的使用。聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)是一种具有良好生物相容性和高生物可降解性的聚合物,其在人体中的应用已被美国FDA批准。PLGA使纳米颗粒具有独特的药物传递特性。PLGA纳米颗粒(PLGA nanoparticles,PLGA NPs)是5-FU给药缓释载体可以改善该药品在癌症病人身上的药代动力学特性,从而提高药物治疗作用。用聚乙二醇(poly ethylene glycol,PEG)对PLGA NPs进行表面修饰改性,可以进一步提高NPs在体内的长循环性能。因此,为延长5-FU药物作用时间、降低不良反应、提高疗效,本研究设计了一种5-FU@PLGA纳米载药微粒用于胰腺癌治疗,通过建立一种长循环缓释药物传递系统增加5-FU在血液中的停留时间。另外,了解5-FU@PLGA纳米载药微粒诱导胰腺癌细胞死亡的方式,有助于我MK-1775 IC50们寻找参与药物发挥作用过程的关键基因,而这些基因可能作为5-FU化学敏感性的预测生物标志物和/或为克服耐药性提供新的分子靶点,具有潜在的治疗价值。值得注意的是,近年来关于细胞焦亡这种新型程序性死亡方式的研究备受关注,这种死亡方式已经被证实在很多肿瘤发生发展进程中起到不可或缺的作用。因此,本课题旨在对5-FU@PLGA载药纳米微粒通过诱导细胞焦亡治疗胰腺癌的作用和机制进行探索性研究。方法人胰腺癌细胞株SW-1990-LUC、小鼠胰腺癌细胞株PANC0chlorophyll biosynthesis2-LUC均在37℃、5%CO2条件下常规培养。本研究采用经FDA批准的、可用于人体临床治疗的PLGA-PEG作为材料,制备纳米微粒5-FU@PLGA NPs和Cy5-5-FU@PLGA NPs,并鉴定其粒径、电位、微观形貌、载药率等粒子表征。在体外实验研究中,首先以游离5-FU及5-FU@PLGA NPs(有效5-FU浓度为13mg/mL)分别处理胰腺癌细胞系SW-1990-LUC和PANC02-LUC,在药物作用0 h、24 h、48 h、72 h后通过显微镜下观察细胞形态,在0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72h后采用CCK-8法检测细胞活性,以初步验证5-FU@PLGA NPs对胰腺癌细胞的杀伤能力及其缓释作用。其次,采用0、13、65、130mg/mL不同有效药物浓度的5-FU@PLGA NPs处理SW-1990-LUC和PANC02-LUC细胞株,加药后在0 h、24 h、48 h、72 h不同时间点通过显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞活性,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH释放情况,Annexin V/PI双染色法检测细胞膜通透性,并通过Western blot方法检测细胞焦亡信号通路中GSDME、Caspase-3等相关蛋白的表达和活化情况。最后,以Caspase-3特异性抑制剂(Z-DEVE-FMK)对胰腺癌细胞SW-1990-LUC和PANC02-LUC进行预处理后再给与5-FU@PLGA NPs处理,显微镜下观察细胞形态并计算焦亡指数,以反向验证Caspase-3参与了5-FU载药纳米微粒诱导胰腺癌细胞焦亡的生物学过程。在体内实验中,我们构建了C57BL/6N小鼠胰腺癌细胞株PANC02-LUC皮下瘤模型,接种肿瘤细胞6天后(肿瘤大小约为400-500mm3)分组给与不同处理,即对照组(PBS组)、游离药物组(5-FU组)和载药纳米微粒组(Cy5-5-FU@PLGA NPs组),各组连续3天经腹腔注射PBS/相应药物(有效5-FU浓度为10mg/kg),并测量小鼠体重和肿瘤体积,连续观察21天后停止测量并安乐死小鼠;绘制小鼠体重和肿瘤体积变化曲线,以及生存曲线;采集各组肿瘤组织,通过H&E法检测各组肿瘤组织变化并对5-FU@PLGA NPs组各主要脏器进行H&E法检测,以此证明5-FU@PLGA NPs具备良好的生物安全性,采用免疫组化检测细胞焦亡信号通路中Caspase-3的活化情况,以印证细胞焦亡的发生及其通路。结果采用PLGA材料,成功制备5-FU@PLAG NPs和Cy5-5-FU@PLGA NPs。通过观察相同药物浓度不同作用时间条件下细胞形态并检测细胞存活率,我们发现与游离5-FU组相比,同等浓度下5-FU@PLAG NPs对于胰腺癌细胞同样具有杀伤能力,且5-FU@PLAG NPs作用时间更长。CCK-8检测结果显示,药物作用48 h前,游离5-FU组及5-FU@PLAG NPs组细胞存活率均随作用时间增加而降低,游离5-FU组在药物作用48 h后其细胞存活率JQ1化学结构随作用时间增加变化不明显,而5-FU@PLAG NPs组在药物作用的72 h内其细胞存活率均随作用时间增加而降低;值得注意的是,药物作用60 h前,5-FU@PLAG NPs组与游离5-FU组的细胞存活率均有显著差异(P<0.05),而作用72h后两组的细胞存活率无显著差异(P>0.05)。以上结果初步证明了5-FU@PLAG NPs的有效性及缓释作用,在此基础上,我们采用不同浓度的5-FU@PLAG NPs处理SW-1990-LUC和PANC02-LUC细胞后发现:(1)在不同药物浓度相同作用时间的情况下,SW-1990-LUC和PANC02-LUC细胞表面出现的“空泡”数量随药物浓度增加而增加,而相同药物浓度时,随着作用时间的延长,“空泡”征也在不断增多,表明焦亡发生具有剂量-时间依赖性。(2)CCK-8实验结果表明5-FU@PLAG NPss能显著抑制SW-1990-LUC和PANC02-LUC细胞活性,随着药物浓度增高细胞活力明显降低,另外,65 mg/mL组与130mg/mL组相比P>0.05,无显著统计学差异,并且其存活率均大于50%,说明这两个药物浓度均处于IC50范围内。(3)LDH释放实验结果显示随着药物浓度增加SW-1990-LUC和PANC02-LUC细胞的LDH释放率均明显增加,65 mg/mL组与130mg/mL组相比无统计学差异(P>0.05),与CCK-8实验结果相符,因此选择65mg/mL进行后续的Annexin V/PI双染实验。(4)Annexin V/PI双染实验,实验结果表明药物浓度65mg/mL处理下,SW-1990-LUC和PANC02-LUC在Annexin V+/PI+、Annexin V+/PI-两个象限中的细胞比例较对照组均显著增加。(5)Western Blot结果显示在0、13、65、130mg/mL四组中均检测到GSDME全长蛋白(GSDME-FL)的表达,加药后可见GSDME切割活化后的条带(GSDME-N),而0mg/mL组未见活化条带;与之类似,在四组细胞加药后均出现Caspase-3切割活化条带(Cleaved-caspase-3),而0mg/mL组未见活化条带。以上结果提示SW-1990-LUC和PANC02-LUC细胞本底高表达GSDME,且GSDME、Caspase-3参与了5-FU@PLAG NPs诱导胰腺癌细胞焦亡的生物学过程,为了反向验证Caspase-3在此过程中的作用,我们应用Caspase-3特异性抑制剂Z-DEVD-FMK开展了抑制实验。实验结果表明随着Z-DEVD-FMK作用时间的增加出现“空泡”征的焦亡细胞未见明显增加甚至略有下降,而对照组焦亡细胞明显增加,达到72 h后趋于稳定。在动物实验中,我们成功构建了C57BL/6N小鼠胰腺癌皮下肿瘤模型,并对小鼠进行分组处理(PBS组、游离5-FU组、Cy5-5-FU@PLGA NPs组),可见5-FU@PLGA NPs组小鼠体重呈现稳定增加的趋势,肿瘤体积在连续3天给药后的第4天明显缩小,于第6天处于几乎完全消失状态,;游离5-FU组肿瘤体积缩小现象的发生晚于5-FU@PLGA NPs治疗组,在8天后消失处于几乎完全消失状态,且小鼠体重同5-FU@PLGA NPs治疗组呈稳定增长但体重增长幅度略低于5-FU@PLGA NPs治疗组,生存时间也略短于Cy5-5-FU@PLGA NPs组;PBS组小鼠随着肿瘤体积的增大,体重与之相反呈现稳步减低的趋势,且生存周期较游离5-FU组和Cy5-5-FU@PLGA NPs组明显缩短(均小于40天)。取肿瘤组织对三组进行H&E染色发现游离5-FU组和5-FU@PLGA NPs组与PBS组相比,两组中均出现组织结构不完整,且局部出现出血性坏死,进一步证明Cy5-5-FU@PLGA NPs药物有效性;对5-FU@PLGA NPs组中各重要脏器进行H&E染色,各脏器细胞结构完整并未出现凋亡或坏死等异常的结构改变,此现象在药物有效性基础上进一步证明5-FU@PLGA NPs药物具有良好的生物安全性,不会对体内其他脏器造成严重影响;对Cleaved-caspase3进行免疫组化检测发现游离5-FU组和5-FU@PLGA NPs组的肿瘤组织中活化的caspase-3明显上调;并对每组小鼠生存时间进行监测并记录绘制生存分析曲线发现Cy5-5-FU@PLGA NPs组较游离5-FU组相比小鼠生存时间均相对延长,再次证明Cy5-5-FU@PLGA NPs的有效性及安全性。动物实验结果提示5-FU@PLGA NPs在小鼠体内具有良好的生物安全性及有效性,并且caspase-3参与药物诱导细胞焦亡的生物学过程。结论1.5-FU@PLGA NPs具有与游离5-FU相同的药物活性,且较游离5-FU相比具有缓慢释放药效的能力,可延长5-FU药物作用时间。2.体外实验表明5-FU@PLGA NPs通过Caspase3-GSDME通路诱导细胞焦亡。3.动物实验表明5-FU@PLGA NPs具有良好的生物安全性及有效性,并且GSDME参与了药物诱导细胞焦亡的生物学过程。