【目的】基因治疗作为一种很有前途的新兴技术,可以治疗许多复杂性疾病,开发安全有效的核酸递送载体是实现基因治疗的关键。聚乙烯亚胺PEI是研究最广的阳离子基因载体,其转染效率与分子量成正比,然而高分子量的PEI具有较高的细胞毒性,很大程度上限制了它的应用。壳聚糖因具有较好的生物相容性也可作为基因治疗的载体,然而单独的壳聚糖溶解性差、转染效率低。本研究以低分子量的PEI(PEI_(600))、和β-环糊精(β-CyD)作为骨架,修饰羧甲基壳聚糖CMCS,合成了一种新型的基因纳米载体CMCS-PEI_(600)-CyD,并在细胞水平对其作为基因载体和免疫治疗中的应用进行了研究。【方法】1.利用化学合成方法依次对壳聚糖进行解聚和羧甲基化得到羧甲基壳聚糖CMCS,合成纳米载体PEI-CyD,将PEI-CyD与CMCS耦合形成CMCS-PEI_(600biomimetic robotics)-CyD纳米载体;2.利用静电作用制备CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA纳米复合物,考察复合物的形态、粒径大小、表面电荷以及对DNA的包裹能力;3.以EGFP绿色蛋白为报告基因,比较在人肾上皮细胞系293T和人树突状细胞h DCS上,不同质量比及不同载体的转染效果;4.以萤火虫荧光素酶p Luc为报告基因,定量检测不同载体在人肾上皮细胞系293T和人树突状细胞h DCS上的转染效率;5.利用CCK-8实验检测不同载体对人肾上皮细胞系293T及小鼠骨髓来源树突状细胞DC2.4的细胞毒性;6.在DC2.4细胞中转染CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA纳米复合物,通过q PCR检测IL-10、ILselleck Belumosudil-6、TNF-α、IL-1β等细胞因子在m RNA水平的表达;7.在DC2.4细胞中转染CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA纳米复合物,利用ELISA技术检测纳米复合物转染后细胞上清液中的IL-6、IL-12、TNF-α、IL-1β等细胞因子蛋白的表达;8.DC2.4细胞转染CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA纳米复合物后,流式细胞术检测DC2.4细胞表面分子(如CD80、CD86、MHCⅡ类分子)的表达,以此作为细胞成熟的标志。【结果】1.透射电镜发现,CMCS-PEI_(600)-CyD纳米载体(简称CPC)可以将DNA很好的包裹成球形粒子;纳米复合物CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA的粒径约为118 nm,表面电荷为23 m V左右;琼脂糖凝胶电泳结果表明,当纳米复合物CMCS-PEI_(600)-CyD/pDNA在质量比为0.5:1时,CPC可将质粒DNA完全包裹;2.细胞转染实验发现,当质量比为20:1时,CPC/p GFP纳米复合物达到最佳转染效率;3.定量实验证明,当质量比为20:1时,CPC/p Luc在293T细胞和h DC细胞上均具有最佳转染效率,且转染效率优于羧甲基壳聚糖CMCS、PEI_(600)、PEI-CyD;4.采用CCK-8法测定CMCS-PEI_(60selleck ABT-2630)-CyD/pDNA纳米复合物293T和DC2.4的细胞活力,结果发现纳米载体CPC具有较低的细胞毒性;5.CMCS-PEI_(600)-CyD/pluc纳米复合物转染后,促进了m RNA水平IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β等细胞因子的表达;6.CMCS-PEI_(600)-CyD/pluc纳米复合物转染后,促进免疫因子IL-6、IL-12、TNF-α、IL-1β及DC2.4表面分子CD80、CD86、MHCⅡ的上调,进而促进了细胞的成熟。【结论】本课题构建的纳米载体CMCS-PEI_(600)-CyD,是一种高转染效率且低毒性的新型载体,该载体在人肾上皮293T细胞和人树突状h DCS细胞上可以促进基因的高效转染,该载体还可促进免疫因子及DC细胞的成熟,发挥潜在的免疫激活作用。