β地中海贫血(β-thalassemia,β-thal)是由于β珠蛋白基因突变导致的遗传性疾病。输血、干细胞移植、基因治疗对β地中海贫血患者有较好的疗效,但也存在明显的局限性和并发症。小分子RNA-144(MicroRNA-144,miR-144)和小分子RNA-451(MicroRNA-451,miR-451)是红细胞中表达最丰富的两个小分子RNA(MicroRNA,miRNA),我们的已发表文章表明,miR-144/451保护正常红细胞的发育,发挥着抗氧化、抑凋亡和促分化的作用Cobimetinib IC50。然而,miR-144/451是否也保护β地中海贫血的红细胞生成尚不清楚。我们将miR-144/451基因敲除小鼠(mKO小鼠,轻度贫血)与β地中海贫血小鼠(th~(3+/-)小鼠,重度贫血)杂交,以研究敲除miR-144/451是否会加重th~(3+/-)小鼠的贫血。我们意外地发现,mKO/th~(3+/-)双基因突变小鼠的贫血显著改善,主要表现为:红细胞数量、血红蛋白浓度和红细胞压积均增加,红细胞分布宽度和网织红细胞数量均减少,脾脏缩小且脾脏结构相对正常,脾脏和骨髓中的有核红细胞数量减少。为了研究这一改善是否与年龄相关,我们检测了 14-15月龄mKO/th~(3+/-)小鼠的各项指标,结果发现该小鼠的贫血状况仍显著改善。综上所述,我们的研究结果表明,敲除miR-144/451基因可以显著改善th~(3+/-)小鼠的无效造血,进而改善贫血,并且这一改善在不同年龄小鼠中均存在。为了探索mKO/th~(3+/-)小鼠贫血改善的机制,我们分选了贫血改善前后的小鼠骨髓有核红细胞,用于转录组基因芯片分析,基因富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)结果显示 NF-E2 相关因子(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信号显著激活。Nrf2是抗氧化反应中关键的调节因子,生物信息学预测网站TargetScan提示Nrf2是miR-144潜在的靶基因,我们课题组前期研究已经证明了它们之间的直接靶向关系。与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠的Nrf2 mRNA水平和蛋白水平均升高。我们进一步通过与Nrf2敲除(nKO)小鼠杂交,评估Nrf2失活对mKO/th~(3+/-)小鼠的影响。实验结果显示nKBMS-907351采购O/mKO/th~(3+/-)三基因突变小鼠的贫血加重,表现为小鼠体积较小,外周血网织红细胞增多,脾脏体积有所增大,脾脏结构趋于紊乱。这些结果表明,敲除miR-144/451后增加的Nrf2在改善mKO/th~(3+/-)小鼠贫血方面发挥了作用。此外,我们构建了 miR-144和miR-451单基因敲除小鼠,并与th~(3+/-)小鼠进行杂交。我们顺利获得了 miR-144 KO/th~(3+/-)小鼠,该小鼠贫血也得到了改善,改善程度稍低于mKO/infectious uveitisth~(3+/-)小鼠。但是,我们未能成功杂交出成年的miR-451 KO/th~(3+/-)小鼠,仅获得一只幼年的miR-451 KO/th~(3+/-)小鼠,且状态极差,在1月龄时死亡。我们综合分析mKO/th~(3+/-)、miR-144 KO/th~(3+/-)和 miR-451 KO/th~(3+/-)这三种小鼠的贫血状况,发现在mKO/th~(3+/-)小鼠贫血改善中,miR-144的敲除发挥着主要的保护作用,而miR-45 1的敲除可能加重th~(3+/-)小鼠的贫血。值得注意的是,mKO/th~(3+/-)小鼠的贫血改善优于miR-144 KO/th~(3+/-)小鼠,说明miR-144和miR-451的同时敲除确实发挥着协同作用,在缺乏miR-144的情况下,miR-451的缺失也可能保护/th~(3+/-)小鼠的红细胞。为了寻找除Nrf2之外的可能机制,我们进一步分析转录组芯片数据,发现与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠有核红细胞对炎症因子,如肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和干扰素-α(Interferon-α,IFN-α)等的反应明显减弱。已有文献报道炎症是引起贫血的一个重要因素,因此我们猜测mKO/th~(3+/-)小鼠贫血的改善与炎症反应的减轻相关,于是我们利用蛋白芯片检测了贫血改善前后的两组小鼠外周血血浆中炎症因子的表达水平。蛋白芯片结果显示,贫血改善后的mKO/th~(3+/-)小鼠血浆中有众多炎症因子水平下降,下降最明显的七种炎症因子是 TIMP-2、IL-12p40/p70、TNF-α、IL-6、IL-10、SDF-1、IL-3。为了进一步验证炎症反应减轻是贫血改善的原因而不是结果,我们利用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)慢性刺激正常小鼠产生炎症后,发现小鼠出现明显的贫血。此外,我们又对严重贫血的th~(3+/-)小鼠进行地塞米松(Dexamethasone,DEX)抗炎治疗,发现抗炎治疗后的th~(3+/-)小鼠贫血明显改善,说明炎症反应的减轻是贫血改善的原因。我们课题组的已发表数据表明,Cab39是miR-451重要的直接靶基因,敲除miR-144/451后Cab39表达水平明显上调,另有文献报道Cab39/AMPKα的激活可以抑制炎症反应,所以我们假设miR-144/451敲除后th~(3+/-)小鼠贫血的减轻是由于Cab39水平的增加,激活了Cab39/AMPKα/mTOR信号通路,抑制炎症反应,最终引起贫血的改善。为了验证该通路,我们首先验证了 mKO/th~(3+/-)小鼠体内Cab39和p-AMPKα蛋白水平的上调,其次我们利用该信号通路上mTOR的抑制剂雷帕霉素在th~(3+/-)小鼠体内进行干预,干预后的th~(3+/-)小鼠贫血显著改善,以上结果均证实了 Cab39/AMPKα/mTOR信号通路在mKO/th~(3+/-)小鼠贫血的改善过程中可能发挥着重要作用。我们利用具有抗炎作用的中药南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(Celastrus orbiculatus extract,COE)治疗th~(3+/-)小鼠,实验结果表明治疗后的th~(3+/-)小鼠,外周血红细胞成熟度、脾脏和骨髓的代偿造血情况均有所改善,同时脾脏和骨髓中的炎症细胞比例也明显降低,上述结果表明COE对th~(3+/-)小鼠具有一定的治疗效果。综上所述,我们的研究结果表明:(1)敲除miR-144/451可以显著改善th~(3+/-)小鼠的贫血,且这种改善部分由miR-144/Nrf2轴介导;(2)敲除miR-144/451后th~(3+/-)小鼠贫血的改善也与小鼠体内炎症水平的降低密切相关;(3)在红细胞中miR-144和miR-451,哪个小分子占主导地位,取决于应激类型或疾病种类。我们的研究还表明,珠蛋白基因突变是β地中海贫血的根本原因,但贫血的严重程度还取决于表观遗传修饰物,如miRNA;(4)具有抗炎作用的COE治疗th~(3+/-)小鼠后,贫血部分改善。论文主要包括四个部分:(1)研究miR-144/451基因敲除后,不同年龄段的th~(3+/-)小鼠贫血改善情况;(2)探索Nrf2在miR-144/451基因敲除后th~(3+/-)小鼠贫血改善中发挥的作用;(3)研究炎症在miR-144/451基因敲除后th~(3+/-)小鼠贫血改善中发挥的作用;(4)探索南蛇藤茎乙酸乙酯提取物在治疗th~(3+/-)小鼠中发挥的作用。第1章miR-144/451基因敲除后各年龄段β地中海贫血小鼠贫血均明显改善目的:研究miR-144/451基因敲除后各年龄段的β地贫小鼠贫血改善情况。方法:我们将miR-144/451基因敲除小鼠(mKO)与β地中海贫血小鼠(th~(3+/-))杂交后,获得适龄的子代小鼠,包括WT、mKO、th~(3+/-)和mKO/th~(3+/-)这四种基因型小鼠。收集四种基因型小鼠外周血,涂片后进行瑞氏吉姆萨染色,观察细胞形态的变化;应用流式细胞术检测四组小鼠外周血、骨髓和脾脏中不同发育阶段红细胞的比例,判断红细胞成熟度;通过组织学方法(HE染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色),分析小鼠脾脏代偿造血情况;观察14-15月龄小鼠的表型改变,并汇总各个年龄段小鼠的脾重指数,判断敲除miR-144/451后β地贫小鼠的贫血是否可以持续改善。结果:(1)外周血涂片染色结果显示,与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠红细胞形态明显改善,细胞大小均一,网织红细胞数量减少;(2)流式细胞术检测结果显示,与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠外周血、骨髓和脾脏中成熟红细胞比例明显增加;(3)脾脏大小和组织学染色结果显示,与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠脾脏体积明显减小,组织结构趋于正常;(4)在14-15月龄小鼠中,mKO/th~(3+/-)小鼠外周血网织红细胞比例减少,脾脏缩小。结论:β地贫小鼠敲除miR-144/451基因后,贫血明显改善,并且在老年小鼠中也明显改善。第2章Nrf2在miR-144/451基因敲除后β地中海贫血小鼠贫血改善中的作用目的:探索Nrf2在miR-144/451基因敲除后β地贫小鼠贫血改善中发挥的作用。方法:我们分选出WT、mKO、th~(3+/-)和mKO/th~(3+/-)这四种基因型小鼠的骨髓有核红细胞,进行转录组芯片分析,通过GSEA筛选出Nrf2相关通路。应用Western Blot在蛋白水平验证Nrf2的表达,应用流式细胞术检测小鼠外周血活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平。为了进一步验证Nrf2在mKO/th~(3+/-)小鼠贫血改善中的作用,我们运用遗传学手段杂交出nKO/mKO/th~(3+/-)三基因突变小鼠,观察该小鼠的多种红系相关指标;同时为了明确mKO/th~(3+/-)小鼠贫血改善到底是miR-144还是miR-451在发挥作用,我们构建了 miR-144和miR-451单基因敲除小鼠模型,再分别与th~(3+/-)小鼠杂交,进一步观察子代小鼠的贫血情况。结果:(1)小鼠有核红细胞的转录组芯片结果经GSEA分析提示,与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠的Nrf2通路激活;(2)与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠14.5天胚胎肝细胞中总的Nrf2和磷酸化的Nrf2水平均显著上升,外周血红细胞中ROS水平下降;(3)与mKO/th~(3+/-)比较,三基因突变小鼠nKO/mKO/th~(3+/-)外周血网织红细胞比例显著增加,脾脏体积有所增加且组织结构趋于紊乱;(4)β地贫小鼠仅敲除miR-144基因后,外周血成熟红细胞比例增加;(5)我们未能成功杂交出成年miR-451缺陷的th~(3+/-)小鼠,仅获得了一只miR-451KO/th~(3+/-)小鼠并且在一月龄的时候死亡。结论:miR-144/451基因缺失后β地贫小鼠贫血的改善,部分归因于miR-144基因的敲除,这可能与miR-144/Nrf2轴相关。miR-451的单一缺失会加重β地贫小鼠的贫血,但是,在同时缺乏miR-144时,miR-451的缺失也可以改善β地贫小鼠的贫血。第3章炎症在miR-144/451基因敲除后β地中海贫血小鼠贫血改善中的作用目的:研究炎症在miR-144/451基因敲除后β地贫小鼠贫血改善中发挥的作用。方法:我们进一步对小鼠有核红细胞转录组芯片数据进行分析,发现贫血明显改善的mKO/th~(3+/-)小鼠与th~(3+/-)小鼠相比,炎性反应信号明显减弱。为了验证mKO/th~(3+/-)小鼠体内整体炎症水平的变化,我们采集小鼠外周血,分离出血浆后检测小鼠血浆中40种炎症因子的表达水平。为了确认炎症因子TNF-α和IL-6对红细胞发育的影响,我们分选了小鼠14.5天胚胎肝红系前体细胞进行体外培养,在培养基中加入重组细胞因子TNF-α和IL-6,通过流式细胞术检测红细胞发育情况;为了确认炎症反应的降低是贫血改善的原因,我们利用LPS慢性刺激正常小鼠产生炎症,同时利用地塞米松降低β地贫小鼠的炎症,观察小鼠各项贫血指标的变化;结合我们课题组前期研究结果和相关文献,我们寻找出了 miR-451/Cab39/AMPKα/mTOR这条可能发挥作用的信号通路,并通过Western Blot在蛋白水平进行验证,同时利用雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)对通路中重要的靶点mTOR直接进行小鼠体内干预实验,观察小鼠各项贫血指标的变化。结果:(1)转录组芯片结果显示:与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠骨髓有核红细胞中多条炎症通路信号减弱;蛋白芯片结果显示:与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠血浆中众多炎症因子水平降低;(2)在小鼠胚胎肝红系前体细胞培养基中加入重组细胞因子TNF-α和IL-6后,Ter1 19+CD71+细胞比例降低;(3)LPS慢性刺激正常小鼠后,外周血网织红细胞比例增加,脾脏增大,脾脏和骨髓中有核红细胞比例增多;地塞米松抗炎治疗β地贫小鼠后,外周血网织红细胞比例减少,脾脏缩小,脾脏和骨髓中有核红细胞比例减少;(4)与th~(3+/-)小鼠相比,mKO/th~(3+/-)小鼠有核红细胞中Cab39和p-AMPKα蛋白水平显著增加;(5)mTOR的抑制剂雷帕霉素干预后,β地贫小鼠外周血网织红细胞比例减少,脾脏缩小,脾脏和骨髓中有核红细胞比例减少,脾脏和骨髓中M1型巨噬细胞比例减少,血浆中TNF-α水平降低。结论:β地中海贫血小鼠敲除miR-144/451基因后,贫血的改善与炎症减轻相关。在β地贫小鼠中,miR-144/451基因敲除激活Cab39/AMPKα/mTOR信号通路,从而抑制炎症反应,最终改善贫血。第4章南蛇藤茎乙酸乙酯提取物在β地中海贫血小鼠治疗中的研究目的:探索南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(Celastrus orbiculatus extract,COE)在治疗β地贫小鼠中的作用。方法:我们采用灌胃的方法给予β地贫小鼠COE进行治疗。将实验小鼠分为对照组(生理盐水)和治疗组(COE),根据参考文献,治疗组又分为50mg/kg和100 mg/kg两个浓度,连续灌胃14天后,观察小鼠的红系指标以及炎症细胞的比例,主要包括:采集小鼠外周血,进行全血细胞分析;通过流式细胞术检测外周血、骨髓和脾脏中的红细胞成熟度;通过流式细胞术,检测骨髓和脾脏中炎症细胞的比例。结果:(1)COE治疗th~(3+/-)小鼠后,全血细胞分析显示小鼠红细胞数量、血红蛋白浓度和红细胞压积均有所增加,外周血网织红细胞减少;(2)COE治疗th~(3+/-)小鼠后,小鼠脾脏缩小,组织结构好转,脾脏和骨髓有核红细胞均减少;(3)COE治疗th~(3+/-)小鼠后,小鼠脾脏和骨髓的炎症细胞比例显著减少。结论:COE治疗th~(3+/-)小鼠后,贫血有轻度改善,可能与COE的抗炎作用有关。