研究背景:随着全球进入老龄化社会,肿瘤持续升高的发病率以及死亡率,不仅迫使各个国家投入大量的人力及财力,而且严重降低人们的生存质量。迄今为止,各类基因疗法、免疫疗法以及分子靶向药联合传统的手术、放疗或化疗,虽然极大延长了患者的生存期,但仍不能明显降低实体瘤患者的死亡率,全球肿瘤的发病率依然呈现急速上升的趋势。细菌凭借其特有的肿瘤靶向能力、细胞的侵袭能力、肿瘤组织的渗透能力再加上近几年合成生物学的兴起使细菌疗法成为肿瘤治疗领域一颗冉冉升起的新星。在细菌抗肿瘤领域,细菌减毒及功能改造是科学家们关注的重点,研究者们通过各种途径敲除细菌的毒性基因,并进行功能改造,希望能够构建出具有高度肿瘤靶向能力且安全性良好的菌株,利用菌株靶向肿瘤的能力以及自身的免疫原性杀灭肿瘤,但却发现实际与理论存在巨大的差异,因为在细菌毒性和疗效之间很难找到一个平衡点。随后科学家转而借用基因工程技术改造细菌,将其打造成可携带各种物质的微型“机器人”,利用细菌的肿瘤靶向能力将外源性物质带到肿瘤局部发挥作用。沙门氏菌能MC3化学结构通过自身独特的分泌方式可将含有外部基因的重组质粒转运至真核细胞内并表达,因此沙门氏菌可作为细菌治疗的良好载体;基因定向酶前体药物治疗(GDEPT)是一种前体药物传递治疗系统,它主要由三个部分构成:一个携带外源基因的载体,一个非活性药物(前药物)以及一个可编码将无活性前体药物转化为活性药物的酶的基因;在GDEPToxicogenic fungal populationsT治疗策略中,ePNP/MePdR前药系统因具有强大的抗肿瘤效应及旁观者效应而备受人们关注,其原理是ePNP可将无毒的MePdR转化为有毒的MeP,MeP可通过影响细胞DNA、RNA、蛋白质等物质的合成起到杀伤细胞的作用。研究目的AY-22989:既往研究已表明以病毒、细菌为载体介导的ePNP/MePdR前药系统在黑色素瘤、胰腺癌、结肠癌等癌种模型中可表现出强大的抗肿瘤效应,但以沙门氏菌为载体进行膀胱癌的抗肿瘤研究目前国内外还未见报道。本研究首先构建出携带ePNP基因的质粒,探究其是否可在沙门氏菌中稳定表达;其次通过体外试验验证携带有ePNP/MePdR前药系统的沙门氏菌具有杀伤小鼠膀胱肿瘤细胞的效果,希望能为进一步研究ePNP/MePdR前药系统以及沙门氏菌抗肿瘤治疗作铺垫。研究方法:本实验首先通过GenBank中提供的ePNP的核苷酸序列设计出引物,从大肠杆菌DH5α中克隆出目的基因,构建出携带有目的基因的真核表达质粒;将携带有ePNP基因的重组质粒电转到沙门氏菌中,该菌为实验室前期构建的严格厌氧的减毒鼠伤寒沙门氏菌,通过基因测序进行初步鉴定;最后通过细胞、细菌体外共培养实验验证携带ePNP目的基因的重组沙门氏菌对小鼠膀胱肿瘤细胞具有直接杀伤作用。结论:本实验成功构建出携带ePNP/MePdR自杀基因系统重组质粒的减毒沙门氏菌;体外实验表明携带ePNP/MePdR自杀基因系统的重组减毒沙门氏菌对小鼠膀胱肿瘤细胞具有良好的杀伤效应,为后续体内研究提供了实验基础。