研究目的:剪接因子SRSF2突变是髓系恶性肿瘤中最常见突变之一。该突变是前白血病的老龄相关性克隆性造血(age-related clonal hematopoiesis,ARCH)的突变之一,并且携带该突变大大增加罹患白血病的几率。在目前的临床应用中,仍缺乏有效的针对剪接因子突变的靶向治疗方法。因此我们希望寻找一系列针对携带SRSF2突变造血干祖细胞的安全治疗和干预措施,即寻找合适的药物对携带该突变的血液恶性肿瘤个体进行治疗,甚至在诊断出白血病之前数年针对携带该突变的高风险个体进行管理。目前,大多数关于该突变导致血液恶性肿瘤的机制研究集中于该突变产生的异常mRNA剪接变化,但尚未完全理解SRSF2突变造血干祖细胞克隆扩增优势的精确机制,以及其他相关的致病机制和表型。因此,除了寻找合适的针对该突变的特异性药物,我们还希望通过寻找SRSF2突变的脆弱治疗靶点来发现该突变的一些新致病机制或表型。研究方法:我们使用CRISPR/Cas9系统产生了数个SRSF2突变的细胞系(OCI-AML2,MOLM-14,K562,OCI-AML3,MARIMO)。并以检测细胞活性率为标准,对3988个化合物进行了高通量药物筛选(high-throughput drug screen,HTS)。最后根据体外筛选结果锁定RKI-1447,一种Rho/ROCK通路抑制剂(Rho-associaBelnacasan小鼠ted protein kinase inhibitor,ROCKi)underlying medical conditions,为先导化合物。我们使用体外 iPSCs(induced pluripotent stem cells)模型和体内PDX模型对RKI-1447的有效性进行验证。为了解其机制和探讨SRSF2突变可能存在的其他未知的致病机制和表型,我们对RKI-1447处理和对照处理细胞进行蛋白组学、转录组学、磷酸化蛋白组学进行分析,并使用共聚焦显微镜和透射电子显微镜(TEM)观察和分析SRSF2突变细胞的细胞骨架(肌动蛋白、微管结构)和细胞核形态,以及RKI-1447处理后对其的影响。我们使用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)研究SRSF2突变和RKI-1447处理对细胞机械力学性质的影响。研究结果和结论:在体外高通量筛选中我们发现ROCK抑制剂RKI-1447能够特异性地抑制SRSF2突变细胞,并且在携带SRSF2突变的iPSC模型中验证了其有效性。通过PDX模型,我们发现RKI-1447能够在体内特异且有效地抑制SRSF2突变的pre-leukemic HSPCs和leukemic HSPCs的植入。通过蛋白组学和转录组学分析,以及细胞周期实验我们发现RKI-1447处理后的细胞产生G2/M阻滞。RKI-1447处理后突变细胞产生显著增多的异常多极纺锤体和多个核细胞和细胞凋亡。共聚焦成像显示,SRSF2突变细胞的细胞骨架与野生型细胞存在差异:肌动蛋白纤维(actin)的质/核分布与野生型存在差异,表现为更明显的细胞核肌动蛋白(nuclear F-actin)和不规则的细胞皮质肌动蛋白(cortical actin)形态。突变型细胞在给药处理后呈现出更为“松散”的物理机械力学状态。相比野生型,突变型细胞的微管结构更加显著,而在给药处理后微管结构进一步加强且杂乱无章。通过TEM,我们发现SRSF2突变细胞有显著的细胞核缩进/凹陷和细胞核分叶,且细胞核两端的细胞核纤层常常连接在一起,将细胞核分割成叶。与野生型细胞相比,突变细胞的细胞核球形度显著不规则,而且RKI-1447处理进一步加重细胞核分叶。我们还观察到分段核的胞浆内突“侵入”细胞核,且侵入的核膜尖端富集了大量微管束。在接受RKI-1447处理后,SRSF2突变细胞的细胞骨架和核形态异常显著增强,并可能与细胞凋亡相关。与细胞骨架形态吻合的是,通过AFM测量细胞,与野生对照相比,突变细胞以及RKI-1447处理后的细胞更加柔软。通过蛋白组学和磷酸化蛋白组学分析,我们发现大量的微管相关蛋白的磷酸化水平在突变细胞和野生细胞间存在差异,并在RKI-1447处理后显著改变其磷酸化水平。其中,作为核纤层蛋白中最重要的支持细胞核机械结构蛋白和生理功能蛋白之一,Lamin A,在经过RKI-1447处理后,在突变细胞中发生了特异性去磷酸化。通过表征Lamin A的磷酸化能挽救RKI-1447处理后细胞活力水平。综上,我们发现了 RKI-1447和可能其他细胞骨架修饰剂能调节SRSF2突变引起的异常细胞骨架,从而特异性抑制SRSF2突变AML,开辟了治疗携带该突变的AML和前期白血病的新途径。我们的结果还揭示了SRSF2突变相关的细胞核和细胞骨架形态异常,以及细胞杨氏模量改变的新表型。未来还需要进一步的研究探索ROCKi或其他细胞骨架调VX-445小鼠节化合物在治疗SRSF2突变的白血病疗效。