植物油是植物种子中主要的高能量贮藏物质,不但具有众多食品和工业用途,还是人类必须脂肪酸的重要来源。开展植物油的合成和调节等方面的研究,不但具有重要的生物学意义,也具有重要的社会和经济意义。植物中油脂合成的生物化学过程已经比较清楚,但其调控机制的研究还不够深入。FUSCA3(FUS3)是少数已报道的正向调控因子,然而,FUS3如何调控油脂代谢的分子机制尚不清楚。本研究对FUS3可能调控的且在种子中高表达的两个AINTEGUMENTA-LIKE基因(AIL6和AIL1)和4个油体钙蛋白CALEOSIN基因(CLO1、CLO2、CLO4和CLO6)进行了功能研究,以深入解析其在FUS3调节油脂代谢中的分子机制。本研究主要获得以下结果:(1)AIL6作为FUS3的下游调节因子通过调节FAD3和FAE1影响种子脂肪酸代谢,通过调节GA、ABA和IAA生物合成及信号通路影响种子休眠:通过诱导表达和双荧光素酶试验确证了FUS3对AIL6的激活表达;通过基因表达分析鉴定了AIL6随着种子发育的成熟表达量逐渐升高;ail6突变体种子脂肪酸组分发生变化,拟南芥AIL6(At AIL6,简称AIL6)和油菜AIL6(Bna AIL6)都可以挽救ail6突变体中脂肪酸组分的变化;在拟南芥中过表达AIL6和Bna AIL6容易引起转基因共抑制,且这种共抑制可以被RNA的RNA聚合酶6(RDR6)的突变体rdr6-11解除;在AIL6高表达的拟南芥或亚麻荠转基因株系种子中,脂肪酸组分发生改变且与ail6突变体的变化相反,具体表现为油酸(18:1)和亚油酸(18:2)的含量显著升高,亚麻酸(18:3)和二十碳一烯酸(20:1)的含量显著降低,尤其是18:2和18:3的变化幅度最大。拟南芥中AIL6过表达系种子的18:2和18:3比率由野生型的1.5提高至5以上。在亚麻荠中过表达AIL6或Bna AIL6后,过表达株系种子中18:2和18:3比率由野生型的0.45提高至1.1以上。对AIL6的32号过表达系和ail6-1突变体发育中种子进行转录组分析发现,AIL6调节脂类代谢相关基因,AIL6过表达后对脂肪酸脱氢酶FAD3和脂肪酸延长酶FAE1的下调表达可能是导致脂肪酸组分变化的原因之一。此外发现,AIL6的超高表达引起种子深度休眠,种子发芽延迟且发芽率降低,发芽率最低降至12%。进一步测定AIL6过表达系种子的植物激素发现,GA_4含量降至野生型的6%以下,Aselleckchem DecitabineBA和IAA含量升高。对发育中种子或发芽的种子外源施加GA_3,不能有效恢复低发芽和发芽延迟的现象。通过划破种皮或延长后熟时间可以使发芽率分别提高至80%和40%。此外,AIL6过表达引起的深度休眠可以被GA受体della五重突变体有效解除。综上所述,这些结果表明AIL6作为FUS3下游调节因子,在脂肪酸代谢和种子休眠中具有重要作用。(2)AIL1作为FUS3的下游调节因子部分通过LPAT5调控脂肪酸代谢和油脂积累,AIL1通过对油质蛋白OLE1和油体tumor immune microenvironment钙蛋白CLO1的表达上调促进营养组织中的油脂积累:在fus3-T突变体中,AIL1的表达下调;FUS3可以激活AIL1的表达;AIL1的表达模式显示AIL1在发育中种子表达量较高,尤其是在开花后12天的种子中表达量最高;ail1突变体种子中脂肪酸组分无明显变化。在拟南芥或亚麻荠中过表达AIL1引起的种子脂肪酸组分的变化与过表达AIL6类似,而Bna AIL1-1在rdr6-11中过表达后,种子脂肪酸组分变化不明显。但值得关注的是,在拟南芥种子中过表达AIL1使得种子含油量升高。在拟南芥幼苗中诱导表达AIL1后,幼苗中三酰甘油的含量显著升高,且油质蛋白OLE1和油体钙蛋白CLO1被上调表达。转录组分析发现,AIL1在拟南芥种子中过表达导致41个脂类相关基因的差异表达,其中LPAT5被上调表达。LPAT5的过表达系种子中18:1含量升高,18:3的含量降低,种子含油量升高。在lpat5突变体中过表达AIL1后,种子含油量无明显变化,且18:1和18:3变化的幅度小于在Col-0背景下过表达AIL1的结果。综上所述,这些结果表明AIL1作为FUS3下游调节因子,在脂肪酸代谢和油脂积累中具有重要作用。(3)油体钙蛋白在种子脂肪酸代谢和油脂积累中功能冗余,且影响胚的发育:4个油体钙蛋白基因CLO1、CLO2、CLO4和CLO6在种子发育过程中高表达;种子表达最高的CLO1及CLO2被FUS3诱导表达上调;clo1、clo2、clo4和clo6单突变体种子的脂肪酸组分变化较小,变化趋势一致,种子含油量无明显变化;分别通过杂交和CRISPR创建的clo1×clo2和clo1 clo2双突变体种子的脂肪酸组分变化明显,种子含油量降低了16-23%。在4个基因沉默(4CLO RNAi T_1)的种子中,含油量降低了40%,脂肪酸组分进一步变化,且胚中的油体变小,油体膜变厚。互补试验显示CLO1和油菜的Bna CLO1在clo1 clo2双突变体种子中可以恢复其脂肪酸组分的变化和含油量降低的表型。在拟南芥幼苗、莲座叶和BY2细胞中诱导表达CLO1可以促进营养组织中三酰甘油的积累。突变了EF-hand模体的CLO1(命名为CLO1 DD)在clo1 clo2双突变体中也可以挽救其种子https://www.selleck.cn/products/iacs-010759-iacs-10759.html脂肪酸组分的变化和含油量降低的现象。此外,4CLO RNAi T_1种子皱缩、种子发芽率降低;部分胚未发育成完整的子叶和下胚轴,甚至还是未分化的圆球形胚;有些萌发的幼苗出现形态异常。对clo1 clo2发育中种子的转录组分析发现,脂类代谢、种子/胚发育、胁迫响应和钙离子信号相关基因表达发生变化。综上所述,这些结果表明种子表达的油体钙蛋白在油脂积累和胚发育中具有重要作用。本研究筛选并鉴定了FUS3下游调节因子AIL6、AIL1和种子表达的油体钙蛋白在脂肪酸代谢中的功能。利用模式植物拟南芥、烟草BY2细胞和油料作物亚麻荠展开研究,并鉴定了油菜中同源基因的功能。对于未来采用基因工程手段,设计改良作物含油量等性状具有重要的意义。本研究还揭示了AIL6在种子休眠中的作用,对控制农作物种子萌发方面也具有潜在应用价值。