真菌毒素是丝状真菌在适当条件下产生的有毒次级代谢产物,对人和动物的健康构成巨大威胁。赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一种由曲霉和青霉产生的次级代谢产物,具有肝毒性、免疫毒性和致癌性,被国际癌症研究机构(IARC)列为2B类致癌物。黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1,AFB_1)是一种由寄生曲霉和黄曲霉产生的次级代谢产物,是黄曲霉毒素中毒性和致癌性最强的物质,被IARC列为1类致癌物。OTA和AFB_1作为两种Structure-based immunogen design剧毒的真菌毒素,广泛存在于黄豆、玉米和大米等农作物中。更重要的是,OTA和AFB_1会共存于一种农作物中,通过协同效应导致毒性增强。因此,亟需建立一种可以同时检测农作物中OTA和AFB_1的方法。本研究制备了抗OTA和AFB_1的双特异性单克隆抗体(Bispecific monoclonal antibody,BsMAb)R428,建立了量子点微球(Quantum dot beads,QBs)免疫层析方法(Lateral flow immunoassay,LFIA),用于黄豆、玉米和大米中OTA和AFB_1的同时检测。主要研究方法和结论如下:(1)分别利用8-氮鸟嘌呤和5-溴脱氧尿嘧啶核苷诱导OTA和AFB_1杂交瘤细胞,得到次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型OTA杂交瘤细胞和胸苷激酶缺陷型AFB_1杂交瘤细胞。采用杂交-杂交瘤技术将其进行融合,经4次亚克隆后获得了4株(2E7、2F7、4B2和3G9)能特异性识别OTA和AFB_1的BsMAb细胞株。通过间接竞争酶联免疫吸附法评价BsMAb的性能,OTA的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))分别为0.65、0.58、0.60和0.67ng/m L;AFB_1的IC_(50)分别为0.29、0.22、0.25和0.26 ng/m L;且特异性良好。选择灵敏度最高的BsMAb-2F7进行抗体亚型鉴定,结果表明BsMAb为Ig G1型。(2)基于传统的抗OTA单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb)和抗AFB_1mAb,分别建立了QBs-LFIA用于检测黄豆、玉米和大米中的OTA和AFB_1。对mAb偶联的p H、EDC用量、mAb标记量、OTA-BSA浓度、AFB_1-BSA浓度和QBs-mAb探针添加量进行了优化。在最优条件下,基于传统抗OTA mAb的QBs-LFIA检测黄豆、玉米和大米中OTA的IC_(50)分别为3.21、2.73和1.47μg/kg,加标回收率为87.21%-132.49%,变异系数为0.51%-12.79%;基于传统抗AFB_1 mAb的QBs-LFIA检测黄豆、玉米和大米中AFB_1的IC_(50)分别为0.05、0.07和0.09μg/kg,加标回收率为80.38%-132.38%,变异系数为2.39%-11.63%。两种方法的检出限均满足我国国标对黄豆、玉米和大米中OTA和AFB_1的限量要求。(3)OTA和AFB_1可能同时存在于一种农作物中,为了提高检测效率,本研究基于制备得到的可特异性识别OTA和AFB_1的BsMAb,建立了一种快速高效的QBs-LFIA用于黄豆、玉米和大米中OTA和AFB_1的同时检测。对BsMAb偶联的p H、EDC用量、BsMAb标记量、OTA-BSA浓度、AFB_1-BSA浓度和QBs-BsMAb探针添加量进行了优化。在最selleck佳条件下,对基于BsMAb的QBs-LFIA进行性能评价,分析本方法的灵敏度和特异性,结果表明基于BsMAb的QBs-LFIA检测黄豆中OTA和AFB_1的IC_(50)分别为0.73μg/kg和0.01μg/kg,玉米中OTA和AFB_1的IC_(50)分别为1.14μg/kg和0.03μg/kg,大米中OTA和AFB_1的IC_(50)分别为1.69μg/kg和0.07μg/kg;且特异性较好。加速保存实验的结果表明本方法较稳定。通过加标回收实验分析本方法的准确性,黄豆、玉米和大米样本的加标回收率为80.20%-130.05%,且变异系数为1.09%-10.41%。因此,本方法具有较好的灵敏度、特异性、稳定性和准确性,适用于黄豆、玉米和大米中OTA和AFB_1的筛查。综上所述,本研究制备了可同时识别OTA和AFB_1的BsMAb,基于这种新型的BsMAb,建立了可以同时检测农作物(黄豆、玉米和大米)中OTA和AFB_1的QBs-LFIA,为OTA和AFB_1的高效定量检测提供了有力的技术支撑。