目的:安罗替尼靶向治疗是治疗癌症的有效方法,但获得性耐药阻碍了其应用和疗效。研究表明,mir-181a-3p作为肿瘤微环境中的细胞间的信息载体,通过多种方式介导肺癌的耐药,其中SHQ1是mi R-181a-3p的潜在下游靶点。根据中医“癌毒传舍”理论探究了靶向药物的耐药问题,并发现扶正口服液有效成分β-谷甾醇对多种类型的癌症具有抗肿瘤作用,可扰乱NSCLC A549细胞周期,诱导该细胞凋亡以及下调EGFR/MAPK信号通路等。但β-谷甾醇通过mir-181a-3p/SHQ1通路改善安罗替尼的耐药性还未进行系统研究。因此本课题探讨并研究了β-谷甾醇通过mir-181a-3p/SHQ1通路降低肺癌细胞对安罗替尼耐药性的作用机制。方法:(1)细胞的建立与培养:用0μM、5μM、10μM、20μM和40μM安罗替尼诱导A54 9细胞24小时,以评估安罗替尼对细胞增殖的影响;用增加剂量的安罗替尼处理A549细胞建立抗安罗替尼A549细胞;设计和合成mi R-181a-3p模拟物和模拟物的阴性对照(模拟物NC),通过使用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen,Carlsband,CA,USA)将其转染A549/安罗替尼细胞。mi R-181a-3p的基因序列为5′-accaugaccguugaugacc-3’,并使用0、10、25和50μg/m L的β-谷甾醇治疗A549和A549/安罗替尼细胞(安罗替尼耐药的A549细胞)。(2)细胞增殖检测:在安罗替尼或β-谷甾醇诱导或细胞转染后24小时,进行CCK-8测定以评估细胞增殖。(3)细胞凋亡检测:采用流式细胞术检测细胞凋亡,并用Flow Jo V10软件分析凋亡细胞的百分比。(4)基因表达检测:mi R-181a-3p的表达通过使用定量实时PC R来测量,并按照2~(-(35)(35)C t)的方法,mi R-181a-3p的基因表达水平被标准化为U6。(5)蛋白质表达检测:westBafilomycin A1ern blot检测SHQ1、激活转录因子(ATF6)和葡萄糖调节蛋白78k Da(GRP78)的表达。(6)荧光素酶报告物测定:使用包括mi RDB和Target Scan Human在内的两个数据库预测mi R-181a-3 p和SHQ1 m RNA 3′-UT R的结合序列并进行荧光素酶报告物测定以检测它们的组合。结果:(1)采用CCK-8法检测A549细胞增殖:发现安罗替尼有效抑制A549细胞的增殖;β-谷甾醇显著抑制A549和A549/安罗替尼的细胞增殖,且对A549/安罗替尼细胞抑制力弱于A549细胞。(2)采用流式细胞检测法检测凋亡细胞:发现β-谷甾醇诱导A549/安罗替尼的细胞凋亡。(3)使用双荧光素酶报告物测定系统测定荧光素酶活性:发现mi GSK J4溶解度R-181a-3p mimics与WT型SHQ1 3′-UTR序列结合时,会降低含野生型SHQ1 3′-UTR序列的质粒上萤火虫荧光素酶的活性,从而证实了SHQ1是mi R-181a-3p的下游靶点。(4)PCR和Western blo t检测:发现β-谷甾醇抑制A549/安罗替尼细胞中mi R-181a-3p的表达并上调A549/安罗替尼细胞中SHQ1的表达;而mi R-181a-3p可抑制A549/安罗替尼细胞中SHQ1的表达。(5)将mi R-181a-3p模拟或模拟NC转Common Variable Immune Deficiency染到A549/安罗替尼细胞中,发现mi R-181a-3p抑制A549/安罗替尼细胞凋亡,促进细胞增殖;mi R-181a-3p过表达减弱了β-谷甾醇对A549/安罗替尼细胞增殖的抑制能力和β-谷甾醇对A549/安罗替尼细胞凋亡的能力,并抑制β-谷甾醇对SHQ1及其下游UPR信号相关的ATF6和GRP78的促表达。结论:β-谷甾醇通过抑制mi R-181a-3p并促进SHQ1及其下游UPR信号相关的ATF6和GRP78的表达,从而调节A549/安罗替尼细胞的增殖和凋亡,减弱非小细胞肺癌的安罗替尼耐药性。