目的:膀胱癌(bladder cancer,BC)是世界上第十常见的肿瘤,也是癌症死亡的第九大原因。每年新增病例超过57万例,新增死亡病例超过21万例。膀胱癌最常见的组织学类型是尿路上皮癌(urothelial carcinoma,UC),占所有膀胱癌的90%。根据肿瘤浸润深度又分为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscular invasive bladder cancer,NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(muscular invasive selleck GSKJ4bladder cancer,MIBC)。NMIBC约占膀胱癌的75%,患者的生存率较高,但极易复发,需要终身随诊和外科治疗。MIBC约占膀胱癌的25%,肿瘤进展快,恶性程度高,易早期转移,也称为转移性膀胱癌,且复发率及病死率高。因此,本项研究旨在对转移性BC的细胞群体及其基因组信息进行分析,为转移性膀胱癌的精准诊疗提供理论基础。方法:3例患者的9个样本均取自于经医学影像和组织病理学检查诊断为肌层浸润性膀胱癌,且未进行术前化疗和放疗。在进行根治性膀胱切除和盆腔淋巴结清扫术后即刻获取每位病人匹配的膀胱癌原位肿瘤组织(primary tumor,PT),癌旁正常组织(paracancerous normal tissue,PNT)和转移的淋巴结(lymph node metastasis,LNM)。然后通过单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,sc RNA-seq)对所有样本进行细胞群体鉴定;进一步通过infer CNV,细胞拟时序,GSVA和nonviral hepatitis细胞通讯等分析方法,研究膀胱癌原位肿瘤与转移淋巴结之间细胞亚群和分子特征的异同性;TCGA数据库评估特异性基因的预后指数;免疫组织化学技术回顾性研究24例MIBC伴淋巴结转移患者的基因表达进行临床验证。结果:1.所有样本共检测到50158个有效细胞,并被鉴定出六种主要的细胞群体,分别是上皮细胞,内皮细胞,成纤维细胞,巨噬细胞,B淋巴细胞和T淋巴细胞。在PT中主要为上皮细胞,巨噬细胞和T淋巴细胞;PNT中主要为成纤维细胞,巨噬细胞和T淋巴细胞;LNM中主要为巨噬细胞和T淋巴细胞。2.接着我们对这些细胞群体进行亚群划分,其中PT中以肿瘤细胞,CD4+调节性T细胞(CD4+regulatory T cells,Treg),CD8+耗竭T细胞(CD8+exhausted T cells,Tex),CD8+驻留记忆T细胞(CD8+resident memory T cells,Trm),肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)和肿瘤相关肌成纤维细胞(Myo-cancerassociated fibroblast,Myo-CAF)为主。这些细胞亚群高表达与促癌相关的基因(SLITRK6,WNT5A,LYVE1和IDO1)。3.PNT中以炎症CAF(inflammatory CAF,i CAF),TAM,CD4+辅助T细胞(CD4+helper T cells,Th)和CD8+细胞毒性T细胞(CD8+cytotoxic T cells,CD8cyto)为主。这些细胞亚群高表达与Th和CD8cyto相关的抗肿瘤免疫应答基因(GZMA,IFNG),同时也高表达与i CAF和TAM相关的促进肿瘤进展基因(SFRP4,LYVE1和IDO1)。染色结果显示PNT中靠近肿瘤细胞区域存在TAM。4.LNM与PT的细胞亚群特征基本一致,但是肿瘤细胞存在差异性表达。通过细胞轨迹分析,PT和LNM分化出两种不同的亚群分支。PT中的亚群以SLITRK6高表达为主,LNM中的亚群以LMO3高表达为主。通过TCGA数据库发现相比SLITRK6,LMO3的高表达与更差的预后相关,提示转移癌细胞的恶性程度更高。染色结果显示PT和LNM中存在不同的肿瘤细胞亚群。5.除了肿瘤细胞,抑制性TTorin 1 NMR细胞亚群(Treg,Tex和Trm)也是PT和LNM的重要特征之一。这些亚群高表达抑制性基因CTLA4,TIGIT和HAVCR2,与促进肿瘤增殖及失去抗肿瘤免疫应答作用相关。我们还发现一个小亚群CD4+细胞毒性T细胞(CD4+cytotoxic T cells,CD4cyto),同CD8cyto一样,其在PNT和恶性组织中出现两种不同的表型,在PNT中发挥正常的细胞杀伤性功能,而在恶性组织中则失去了细胞毒性功能,并参与促进肿瘤细胞的增殖。6.细胞通讯分析显示,CAF几乎涉及所有细胞亚群的信号转导途径,是参与促进肿瘤细胞增殖和抑制性免疫细胞形成的主要信号发出者。其中,i CAF和TAM是激活Tex的信号通路中心。两者通过直接向CD8cyto或者通过激活下游的Treg间接向CD8cyto传递信号,使其成为衰竭表型。该分析阐述了上述三组中出现细胞亚群的差异性分布特征的调控机制。结论:本项研究通过sc RNA-seq首次对转移性BC患者中匹配的PNT,PT和LNM三种样本的细胞群体和分子表达特征进行分析并绘制了单细胞转录组图谱。主要包括:1.PT和LNM的共同特征是存在肿瘤细胞和抑制性免疫细胞(Treg,Tex和Trm)。2.PT和LNM的不同之处是两者的肿瘤细胞存在不同的细胞亚群。相比在PT中高表达的SLITRK6的亚群,在LNM中高表达LMO3的亚群可能与更高恶性程度和更差的预后相关。3.PNT与PT及LNM的共同特征是存在高表达LYVE1和IDO1的TAM,其在PNT中表达可能与提高肿瘤的复发几率相关。我们从细胞群体和基因组层面揭示了三个组织来源的样本中存在的共同和差异性特征,为转移性BC的肿瘤生物信息学研究和今后的治疗方法提供了新的见解。