目前全球糖尿病的发生率越来越高,已成为全球重大公共健康问题。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见的并发症之一,指由持续性的血糖升高导致的慢性肾脏损伤,损伤部位累及肾小球、肾小管、肾间质以及血管。DN也是造成慢性肾衰竭及终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的重要病因。虽然关于DN的发病机制尚未完全阐明,但目前大多数观点认为炎症在其中起着重要的作用。研究发现在肾脏中浸润的炎症细胞如巨噬细胞、中性粒细胞以及其分泌的炎症因子是导致肾脏纤维化发生的重要原因。干扰素刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)是一种内质网跨膜蛋白。STING在各种内皮细胞和上皮细胞以及T细胞、巨噬细胞等免疫细胞中表达,并作为Ⅰ型干扰素(type Ⅱ interferon,IFN-Ⅰ)和先天性免疫系统的主要调节因子在多种疾病的免疫反应中发挥重要作用。研究发现STING在炎症发生发展中发挥重要促进作用。此外,STING可以作为一种潜在的无菌性慢性炎症蛋白介质,在无菌性炎症中发挥重要作用,如肥胖、代谢失调等带来的慢性心血管疾病和代谢性疾病。已有研究发现STING在肾纤维化中发挥重要作用,但STING在DN肾脏损伤,尤其是足细胞及肾小管细胞中的作用仍不清楚。本课题我们发现STING加重DN这种肾脏代谢性相关慢性疾病的炎症反应,促进肾脏组织形态和功能学损伤。使用药物抑制STING活性可显著改善DN肾小球损伤,肾间质免疫细胞以及其分泌的炎症介质浸润,抑制肾纤维化。DN肾小管上皮细胞可通过激活STING-IFN-Ⅰ通路和NF-κB通路促进趋化因子分泌,从而募集循环中的免疫细胞迁移进入肾脏组织,加重肾小球及肾小管区域炎症反应。研究内容为明确STING在糖尿病肾病中的作用与机制,本课题主要开展以下研究:(1)明确STING在糖尿病肾病体内外表达变化。(2)探索STING在糖尿病肾病肾小球和肾小管部位的作用。(3)阐明慢性肾脏疾病中使用STING抑制剂的治疗作用和可行性。(4)体外细胞实验中揭示STING发挥作用的相关分子机制。研究方法与结果第一部分:STING在糖尿病肾病中的表达情况1.1临床糖尿病肾病患者肾组织中STING的蛋白表达水平增加通过免疫组化染色检测DN患者肾活检病理切片中STING的表达水平,结果显示DN患者肾组织中包括肾小球、肾间质和肾小管中STING均表达增加。1.2 DN动物模型中STING蛋白表达水平增加通用Western Blot检测STZ/HFD和db/db两种DN小鼠肾皮质中的表达情况,结果显示,STING均表达增加。1.3检测高糖环境下人源足细胞和肾小管上皮细胞中STING的表达情况在体外细胞实验中,采用高糖(high glucose,HG)处理人源永生化足细胞(human podocyte cells,HPC)和肾小管上皮细胞(human proximal tubule epithelial cells,HK-2),通过Western Blot检测STING及其经典通路中TBK1、IRF3的表达和磷酸化情况,结果显示在足细胞和肾小管上皮细胞中此通路被激活且在肾小管上皮细胞中STING的表达变化更加稳定。第二部分:检测足细胞特异性敲除STING对糖尿病肾病小鼠肾小球损伤的作用2.1构建足细胞特异性敲除STING小鼠通过Cre-loxP重组技术构建足细胞特异性敲除STING小鼠,通过琼selleck产品脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,从而验证STING敲除成功。2.2足细胞特异性敲除STING可改善糖尿病肾病小鼠肾小球损伤(1)STING 由 Tmem173 基因转录。通过对Nphs2.cre-Tmem1 73fl/fl和Nphs2.cre+Tmem173fl/fl 小鼠注射STZ并连续3个月喂食高脂饲料(high fat diets,HFD)诱导DN小鼠模型。(2)收集小鼠尿液,检测尿微量白蛋白与尿肌酐比值(urinary albumin to creatinine ratio,UACR),发现足细胞缺失STING可降低UACR,保护肾功能。(3)通过PAS染色发现足细胞特异性缺失STING可改善由STZ/HFD诱导的肾小球形态损伤。(4)通过透射电镜对小鼠肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)区域进行观察发现足细胞特异性缺失STING可改善由STZ/HFD诱导的足细胞脱落、足突弥漫性融合和肾小球基底膜增厚等肾小球损伤。(5)将小鼠肾脏石蜡包埋并切片,通过免疫组化对Podocin、WT1、Desmin的染色发现足细胞特异性缺失STING可改善由STZ/HFD诱导的肾小球损伤。(6)通过免疫组化染色发现足细胞特异性敲除STING可下调巨噬细胞在糖尿病肾病肾小球中的浸润。第三部分:检测肾小管上皮细胞特异性敲除STING对糖尿病肾病小鼠肾小管损伤的作用3.1构建肾小管上皮细胞特异性敲除STING小鼠(1)通过Cre-loxP重组技术构建肾小管上皮细胞特异性敲除STING小鼠,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,从而验证STING敲除成功。(2)通过Western Blot进一步证明STING敲除成功。3.2肾小管上皮细胞特异性敲除STING可以改善糖尿病肾病小鼠肾脏炎症和纤维化(1)通过对 Cdh16.cre-Tmem173fl/fl和Cdh16.cre+ Tmem173fl/fl小鼠注射 STZ 并连续20周喂食高脂饲料诱导DN小鼠模型。(2)RT-qPCR检测肾皮质部位促炎性细胞因子mRNA的表达水平,结果显示肾小管上皮细胞特异性敲除STING可以下调TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性细胞因子表达;Western Blot结果显示STING的肾小管上皮细胞特异性缺失可改善由STZ/HFD诱导的MPO和MHCI的表达升高;将小鼠肾脏石蜡包埋并切片后通过PAS染色发现STING的肾小管上皮细胞特异性缺失可改善由STZ/HFD诱导的肾小管形态损伤;免疫组化染色结果显示STING的肾小管上皮细胞特异性缺失可改善由STZ/HFD诱导的IL-6的分泌增加,减少巨噬细胞和中性粒细胞等固有免疫细胞以及CD4+T细胞和CD8+T细胞等适应性免疫细胞在肾间质的浸润。综上说明STING的肾小管上皮细胞特异性缺失可改善由STZ/HFD诱导的肾脏炎症反应。(3)Western Blot结果显natural bioactive compound示STING的肾小管上皮细胞特异性缺失可改善由STZ/HFD诱导的α-SMA和Vimentin等肌成纤维细胞标志物的过度表达;通过天狼星红染色和COL1A1免疫组化染色发现STING的肾小管上皮细胞细胞特异性缺失可改善由STZ/HFD诱导的肾间质细胞外基质蛋白增加。综上说明STING的肾小管上皮细胞特异性缺失可改善由STZ/HFD诱导的肾间质纤维化。第四部分:检测药物抑制STING活性对糖尿病肾病小鼠肾脏损伤的作用4.1在糖尿病肾病小鼠注射STING小分子共价抑制剂C176通过对WT小鼠注射STZ并连续20周喂食高脂饲料诱导DN小鼠模型,并在第9周开始对小鼠进行C176腹腔注射,隔天给药,直到获取疾病模型。4.2药物抑制STING活性可改善糖尿病肾病小鼠肾小球损伤(1)收集小鼠尿液,检测UACR,发现C176抑制STING活性可使UACR降低。(2)通过透射电镜对小鼠GBM区域进行观察发现C176抑制STING活性可改善由STZ/HFD诱导的足细胞脱落、足突弥漫性融合和GBM增厚等肾小球损伤。(3)将ABT-199小鼠肾脏石蜡包埋并切片,通过PAS染色和免疫组化对WT1、Desmin的染色发现C176抑制STING可改善由STZ/HFD诱导的肾小球损伤。4.3药物抑制STING活性可改善糖尿病肾病小鼠肾脏炎症和纤维化(1)RT-qPCR检测结果显示C176抑制STING活性可以下调肾皮质TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性细胞因子mRNA的表达水平;Western Blot结果显示C176抑制STING活性可改善由STZ/HFD诱导的MPO和MHCI的表达水平;通过PAS染色发现C176可改善由STZ/HFD诱导的肾小管形态损伤;免疫组化染色结果显示C176抑制STING活性可改善由STZ/HFD诱导的IL-6的分泌增多,减少巨噬细胞和中性粒细胞等固有免疫细胞以及CD4+T细胞和CD8+T细胞等适应性免疫细胞在肾间质的浸润。综上说明C176抑制STING活性可改善由STZ/HFD诱导的肾脏炎症反应。(2)Western Blot结果显示C176抑制STING活性可改善由STZ/HFD诱导的α-SMA和Vimentin等肌成纤维细胞标志物的过度表达;通过免疫组化对FN1、COL1A1染色发现C176抑制STING活性可改善由STZ/HFD诱导的肾间质细胞外基质蛋白增加。综上说明C176抑制STING活性可改善由STZ/HFD诱导的肾间质纤维化。第五部分:体外研究STING在糖尿病肾病肾脏细胞中的作用和机制5.1抑制STING通路激活可以改善高糖诱导的足细胞损伤(1)通过小干扰RNA沉默足细胞中的STING,结果显示沉默后可以改善由HG引起的足细胞裂隙膜蛋白Nephrin、Podocin降低以及足细胞损伤标志物Desmin升高。(2)沉默STING可抑制由HG引起的STING-TBK1-IRF3通路激活;RT-qPCR结果显示沉默STING可改善由HG引起的集落刺激因子GM-CSF和趋化因子CCL5升高。5.2抑制STING通路激活可以改善糖尿病肾病肾小管上皮细胞炎症(1)通过小干扰RNA沉默肾小管上皮细胞中的STING,RT-qPCR结果显示沉默STING后可抑制由HG引起的集落刺激因子GM-CSF和CCL5、CXCL10等驱化因子mRNA水平的升高;通过ELISA检测发现沉默STING可抑制由HG刺激引起的肾小管上皮细胞培养上清中的IFN-α水平升高;Western Blot结果显示沉默STING后可降低MHCI的蛋白表达水平。(2)使用H-151降低STING活性,RT-qPCR结果显示H-151抑制STING活性可改善由HG引起的GM-CSF和CCL5、CXCL10等细胞因子的转录水平升高。(3)使用炎症刺激物脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理肾小管上皮细胞,结果显示通过小干扰RNA沉默STING后可抑制由LPS引起的STING-TBK1-IRF3通路以及NF-κB通路的激活。使用H-151降低STING活性可抑制由LPS引起的STING-TBK1-IRF3通路以及NF-κB通路的激活。5.3糖尿病肾病肾小管上皮细胞中STING的激活受TBK1和cGAS调控(1)使用小分子抑制剂GSK8612抑制TBK1活性,结果显示GSK8612不仅可抑制由HG引起的IRF3的磷酸化以及NF-κB通路激活,同时可以抑制STING磷酸化。(2)通过小干扰 RNA 沉默环 GMP-AMP 合酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS),结果显示沉默cGAS可抑制由HG或LPS引起的STING-TBK1-IRF3通路以及NF-κB通路激活。结论与创新性1.STING在DN中表达增加且累及肾小球、肾小管和肾间质,通过足细胞、肾小管上皮细胞分别条件性敲除STING可以改善DN小鼠肾脏损伤,减少蛋白尿的产生。2.使用药物抑制STING活性可改善DN小鼠肾功能、减轻肾小球损伤、抑制肾间质炎症反应和纤维化进程。3.抑制cGAS-STING通路可改善足细胞损伤和肾小管上皮细胞炎症,并通过减少IFN-I分泌而下调MHCI的表达水平,进而影响适应性免疫细胞在肾脏中的作用。4.本课题发现STING作为cGAS-STING通路的关键调节因子可以加重DN足细胞损伤,促进肾脏炎症和纤维化进程,同时证明了使用STING抑制剂药物治疗DN的可能性,为治疗DN提供了新的潜在治疗靶点。