浅部真菌是自然界最广泛存在的一类真菌病原体,近几十年来,城市化和全球一体化的加快导致由浅部真菌引起的感染在全球范围内不断增加。浅部真菌病的致病真菌专门侵入皮肤及其他浅部组织,会导致患者身体上出现严重瘙痒和致残性损伤,导致社交尴尬,严重地影响个人的生活质量,对于患有糖尿病、免疫缺陷等免疫功能低下的患者中,浅部真菌病可能进展到更深的侵袭性感染而导致严重后果。快速、准确地对临床上常见的浅部真菌病病原体进行鉴定,对预防、诊断治疗浅部真菌感染具有重要意义。本研究biofloc formation旨在建立一种针对常见浅部真菌病病原体的多重荧光定量PCR方法,首先利用二代测序(NGS)技术研究临床浅部真菌病病原体感染分布情况,并结合已经报道各地浅部真菌病原菌分析情况,确定出常见的8种浅部真菌病病原体;针对8种浅部真菌病原体建立多重荧光定量PCR方法,并对方法进行评价;最后对临床收集的非糖尿病人群/糖尿病人群感染浅部真菌的样本进行检测分析。主要研究内容如下:通过对云南昆明地区浅部真菌感染临床样本进行ITS区域靶向扩增富集,并进行扩增子测序分析发现:浅部真菌属水平丰度较高的是毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)、念珠菌属(Candida)和Q-VD-Oph纯度马拉色菌属(Malassezia)。浅部真菌种水平丰度前五是白色念珠菌(Candida albicans)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)和须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes),与已经报道过的云南地区浅部真菌感染优势菌种一致。根据NGS研究的云南昆明地区浅部真菌丰度结果,结合已经报道各地浅部真菌病原菌分布情况,确定了8种常见的浅部真菌病病原体:红色毛癣菌、犬小孢子菌、马拉色菌、絮状表皮癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌、白色念珠菌和奥杜盎小孢子菌,建立基于Taq Man探针的多重荧光定量PCR方法,并对方法进行评价。结果表明:设计的8种病原体引物和探针对病原体检测特异性好、灵敏度高;在单重实时荧光定量的基础上,根据病原菌种属进行分组调整和验证,将8种浅部真菌分为三组,A组包括(红色毛癣菌、絮状www.selleck.cn/products/s-gsk1349572表皮癣菌、犬小孢子菌),B组包括(须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌),C组包括(白色念珠菌、马拉色菌、奥杜盎小孢子菌)。多重荧光定量PCR特异性验证表明,8种浅部真菌引物和探针之间没有交叉扩增反应,特异性强;灵敏度评价表明,A组中浅部真菌的检测下限分别为红色毛癣菌1.03×10~1copies/μl、絮状表皮癣菌1.04×10~1copies/μl、犬小孢子菌1.02×10~1copies/μl,B组中浅部真菌的检测下限分别为须癣毛癣菌3.33×10~1copies/μl、石膏样小孢子菌3.34×10~1copies/μl,C组中浅部真菌的检测下限分别为白色念珠菌7.15×10~1copies/μl、马拉色菌7.3×10~1copies/μl、奥杜盎小孢子菌7.27×10~1copies/μl,灵敏度较高;对多重荧光定量PCR方法进行批内和批间重复性评价,发现三组浅部真菌批内和批间Ct值最大变异系数CV值都小于5%,重复性好。临床样本验证结果证明该多重荧光定量PCR方法检测准确性好。最后从临床收集了非糖尿病人群浅部真菌感染样本45例,糖尿病人群浅部真菌感染样本55例,使用建立的常见浅部真菌多重荧光定量PCR方法对两类人群的临床样本进行检测,结果表明:非糖尿病浅部真菌感染样本检测出43例阳性,糖尿病合并浅部真菌感染的样本52例阳性。非糖尿病浅部真菌感染样本检测出5种真菌单病原体阳性36例包含了白色念珠菌7例,石膏样小孢子菌8例,马拉色菌13例,红色毛癣菌4例,须癣毛癣菌4例,7例(16.28%)样本存在混合感染情况;糖尿病合并浅部真菌感染样本检测出5种真菌单病原体阳性36例包含白色念珠菌19例,石膏样小孢子菌11例,马拉色菌2例,红色毛癣菌3例,须癣毛癣菌1例,有16例(30.77%)存在混合感染情况;对两类人群浅部真菌阳性样本分别按不同性别、年龄组分组研究,发现两类人群浅部真菌感染在不同性别组人群间无显著差异;在不同年龄组人群分组中有显著差异,主要体现在:非糖尿病人群马拉色菌感染主要集中在0-19岁这一年龄段,与报道的浅部真菌感染年龄段特点一致;糖尿病人群白色念珠菌和石膏样小孢子菌感染主要集中在50-59岁这一年龄段,同时发现70-79岁年龄段患者主要感染的是白色念珠菌,与糖尿病患者感染浅部真菌报道的情况一致。综上所述,本文建立了特异性好、灵敏度高、重复性好的常见浅部真菌病原体多重荧光定量PCR的方法,进而分析糖尿病/非糖尿病人群感染浅部真菌病的流行病学特征,研究结果对浅部真菌病的管控和临床的诊治提供了重要的技术方法,为进一步深入研究糖尿病/非糖尿病人群感染浅部真菌病的病原谱流行特征提供重要科学依据。