2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)和3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose,3-FL)是母乳中结构简单且分泌最丰富的中性母乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)。因其具有维持肠道稳态、免https://www.selleck.cn/products/Vorinostat-saha.html疫调节、炎症抑制、抗病毒及促进婴儿大脑发育等多种生理功能而被广泛应用于婴幼儿配方奶粉、老年食品、功能性饮料及保健品等领域。目前,2’-FL和3-FL均已被美国食品药品管理局(FDA)批准为一般公认安全食品(GRAS),并被欧盟批准为新型食品(NF),且在商业化的岩藻糖基乳糖(FL)生产中主要使用大肠杆菌(Escherichia coli)为底盘宿主进行微生物合成。由于微生物合成法具有绿色高效、成本低廉等典型特征,现已逐渐成为FL工业化生产的主要策略。此外,应用于FL生产的岩藻糖基转移酶是代谢过程的主要限速酶,限速酶的性能提升对FL的高效合成至关重要。为此,本论文以具有高底物消耗率且生长迅速的大肠杆菌为宿主,使用代谢工程策略和工具构建了高效生产2’-FL和3-FL的质粒型微生物细胞工厂,通过操控微生物的遗传单元、重构细胞的生化网络,实现了胞内乳糖自合成的FL整合型无抗菌株的构建,同时基于酶工程技术筛选并改善了限速酶α-1,2-岩藻糖基转移酶的生产性能。主要研究内容和结果如下:(1)岩藻糖基乳糖大肠杆菌细胞工厂的构建与优化。以E.coli BL21(DE3)为出发菌株,异源表达从头合成FL的α-1,2/3-岩藻糖基转移酶基因,通过独立或组合过表达基因簇man C-man B和gmd-wca G探究对产物合成的影响,发现组合过表达最有利于FL的生产。不同细菌来源α-1,2/3-岩藻糖基转移酶的筛选表明,H.pylori ATCC 26695的Hpfut C和H.pylori NCTC 11639的七点突变体Hp M32生产FL的效VE-822核磁果最佳。基因lac Z和wca J的敲除结果表明,底物乳糖的利用率得到显著提高,关键前体GDP-L-岩藻糖的胞内积累得到明显改善。利用不同质粒拷贝数组合优化上游关键基因(模块一)和下游糖基转移酶(模块二)的表达水平,获得最佳质粒组合为p RSF-CBGW和p ET-Hpfut C/Hp M32。在胞内建立NADPH和GTP再生系统,比较4组单基因和4组多基因过表达对菌株生产性能的影响,结果表明,含zwf和gsk的过表达菌株生产性能最好。此外,培养基和诱导条件的优化显示,在使用M9CA培养基、诱导温度为25°C,诱导浓度为0.3 m M的条件下,菌株的生长状态和产物合成的协同效果最佳,摇瓶水平下2’-FL和3-FL的产量提升至2.21±0.06 g/L和1.88±0.05 g/L。在3-L发酵罐中进行补料分批发酵,最终产生了24.4 g/L的2’-FL和18.89 g/L的3-FL。(2)基因编辑技术改造底盘微生物及限速酶的性能提升。以E.coli BL21(DE3)Δlac Z为出发菌株,通过一轮至四轮潜在竞争靶基因(nud D、nud K、wca J、lon、mtl D、pfk A、pfk B、fsa A和fas B)的筛选与迭代敲除,上调了三个关键中间体包括果糖-6-磷酸、GDP-D-甘露糖和GDP-L-岩藻糖的碳通量。显著地,lac Z、wca J、nud D、pfk A和lon基因缺失的BZWNDPAL菌株获得了最高生产水平,2’-FL和3-FL的产量分别为6.24±0.14 g/L和3.56±0.11 g/L。通过优化合成生物学元件(启动子、RBS、融合肽以及基因拷贝数)缓解了α-1,2/3-岩藻糖基转移酶低催化活力和低可溶性表达的瓶颈问题。结果显示,在T7启动子和RBS(BBa＿B0034)调控下,菌株产生了7.87±0.14 g/L的2’-FL和5.26±0.12 g/L的3-FL。融合肽ple B促进了岩藻糖基转移酶的可溶性表达。当质粒上串联二拷贝基因时,2’-FL和3-FL的产量进一步提高。通过单因素培养基成分的优化,2’-FL和3-FL的产量提升至9.82±0.16 g/L和6.68±0.14 g/L。最终,在3-L发酵罐的补料分批发酵中,重组菌获得了64.62 g/L的2’-FL和40.68 g/L的3-FL。(3)乳糖合成新途径设计与岩藻糖基乳糖无抗菌株的构建。以BZWNDPAL为出发菌株,敲除了葡萄糖特异性转运蛋白酶EⅡABC~(Glc)组件编码基因crr和pts G,并在该位点整合了糖外排转运蛋白基因set A和葡萄糖转运蛋白基因glf。强化了NPTS~(Glc)系统的菌株BP3的葡萄糖转运速率和细胞生物量相较于初始菌株得到了显著提升。筛选不同来源的β-1,4-Gal T并实现乳糖合成菌株的构建,将gal E基因整合至染色体的ugd位点,将优选的脑膜炎奈瑟球菌来源的Nmlgt B基因整合至glk位点。消除糖酵解模块副产物和阻遏蛋白的抑制并引入FL生物合成途径,在工程菌BP8-0和BP9-0染色体的ack A-pta,pfl B和ldh A位点进一步整合了man C-man B,gmd-wca G和man A表达盒,2’-FL和3-FL的胞外输出含量提升至3.34±0.11 g/L和2.78±0.09 g/L。为了进一步提高FL的产量,基因组上内源的GDP-L-岩藻糖模块关键基因(man A、man B、man C和gmd)的野生启动子被替换为更强的T7启动子,最终菌株BP10-3和BP10-3含有18个基因修饰,摇瓶检测2’-FL和3-FL的胞外输出产量为4.36±0.14 g/L和3.23±0.12 g/L。在3-L发酵罐的补料分批发酵中,菌株在甘油和葡萄糖混合培养中生产了40.44 g/L的2’-FL和30.42 g/L的3-FL。(4)α-1Anti-periodontopathic immunoglobulin G,2-岩藻糖基转移酶的分子改造与性质研究。通过多序列比对设计并建立了17个α-1,2-岩藻糖基转移酶的单双点饱和突变文库,酶法合成供体底物GDP-L-岩藻糖并在此基础上对小型突变库进行体内初筛和体外复筛,最终获得酶活力提升的6个单点突变体K102T、R105C、D115S、Y251F、A255G和K282E。对单点正向突变体进行有序叠加,获得了6个酶活力和可溶性表达同时提高的组合突变体。其中突变体V6的催化活力由野生酶的0.71 U/mg提升至1.62 U/mg。对野生Hpfut C和突变体进行酶学性质研究,结果显示,野生型Hpfut C的最适反应温度为37℃,最适p H为5.0,不属于金属依赖型酶,但Mn~(2+)对反应具有促进作用。突变体K102T、D115S、Y251F和K282E的热稳定性均有不同程度的改善。特别地,突变体V6对底物乳糖和GDP-L-岩藻糖的亲和力和催化速率得到大幅度提升,两种不同底物浓度下突变体V6的K_m值比野生酶分别低34.5%(乳糖)和25.0%(GDP-L-岩藻糖),而k_(cat)/K_m值分别高出1.20和1.25倍。应用Alpha Fold 2预测的结构模型进行分子对接和酶活提升机制分析,结果表明,高刚性结构、新氢键的形成、增加的疏水性氨基酸和有利的静电势可能对突变体的稳定性具有促进作用。