小麦是世界上重要的主粮作物,其生产关系着粮食安全;挖掘小麦生长发育和逆境应答过程中的关键调控基因及其作用机制对小麦生产及粮食安全具有重要意义。miRNA是在真核生物体内发现的一类丰富的内源单链非编码小RNA(长度为21-24 nt);许多miRNA作为有效的转录后调节因子在植物生长发育及生物和非生物逆境胁迫的响应等生物学过程中发挥重要的调节作用。课题组前期构建了小偃6号小麦的小RNA库,通过深度测序分析鉴定出了一些物种特异的miRNA,其中,包括麦类特有的tae-miR5048。但是小麦基因组中miR5048的基因位点、调控的靶基因及其在小麦生长发育及逆境胁迫应答中的作用尚不清楚。本研究结合生物信息学预测、降解组分析、RLM-5’RACE及烟草叶片瞬时共表达分析等技术鉴定和验证tae-miR5048调控的靶基因;利用转基因过表达以及CRISPR/Cas9等技术创制tae-miR5048及其靶基因过表达小麦株系和其功能缺失突变体材料,调查这些小麦材料在生长发育和逆境胁迫下的表型变化,以揭示taemiR5048及其靶基因的生物学功能;同时,通过小麦c DNA文库的酵母双杂筛选以及多种蛋白质互作技术探析tae-miR5048及其靶基因在小麦生长发育及逆境应答过程中的作用机制。本研究取得的主要结论如下:1.小麦基因组上存在3个miR5048基因位点(TaMIR5048-7A、-7B和-7D),其产生的成熟序列相同;tae-miR5048靶向调控小麦TaMAPK1和TaNAK1基因表达。TaNAK1发生可变剪接,生成3个剪接体TaNAK1.1、TaNAK1.2和TaNAK1.3都有激酶结构域和NB-ARC结构域,但三者之间这两个结构域的位置和激酶域的长度不同;在小麦中仅检测到TaNAK1.selleckchem1和TaNAK1.2可变剪接体。2.小麦miR5048、TaMAPK1和TaNAK1在小麦各组织器官均有表达,tae-miR5048在发育早期的幼穗和籽粒中表达量较高,TaMAPK1在叶片表达量较高表达量较高。在条锈菌侵染下,tae-miR5048的丰度降低,TaMAPK1和TaNAK1表达显著上调;在非生物逆境(干旱、高盐、低温、Me JA和ABA等)胁迫下TaMAPK1和TaNAK1显著上调表达。TaNAK1的可变剪接体TaNAK1.1和TaNAK1.2的时空表达模式和逆境(生物逆境和非生物逆境)胁迫条件下的表达模式均不同。TaMAPK1定位于细胞质和细胞核;TaNAK1.1定位于细胞质,TaNAK1.2定位于细胞质和细胞核。3.miR5048的过表达显著抑制小麦TaMAPK1和TaNAK1的表达水平,从而导致小麦提前抽穗和开花、株高增加和籽粒尺寸改变,粒重和单株产量无明显变化;TaNAK1.2过表达导致小麦株高、粒重和单株产量显著下降;TaMAPK1负调控小麦产量相关性状和产量潜力,即:TaMAPK1过表达导致株高和穗长分别降低4.0%-4.7%和13%-19%,籽粒长和宽分别减小3.6%-4Infection diagnosis.6%和0.8%-2.5%,粒重降低5.0%-8.4%,最终导致单株产量降低了16.8%-26.3%;TaMAPK1的单基因功能缺失突变体mapk1-aa和mapk1-bb抽穗和扬花时间均提前7天左右,株高、旗叶面积和穗长分别增大9.4%-12.4%、56.8%-104.3%和26.4%-34.0%,籽长和粒重分别增大1.9%-5.4%和8.4%-15.1%,最终导致单株产量增加约10%。4.在小麦条锈病原菌CYR31侵染下,与野生型小麦Fielder相比,miR5048Captisol过表达小麦对抗病性降低,TaMAPK1或TaNAK1.2过表达小麦抗病性增强。转录组分析发现,在小麦条锈病原菌侵染下,TaMAPK1过表达小麦中信号传递相关蛋白(包括植物硫因子受体2、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶、酸性磷酸酶和钙调蛋白5/6/7/8等)、转录因子(包括TaWRKY35、TaWRKY70和b ZIP转录因子TaTGA2.1等)、及小麦病原菌抗性相关基因(包括NBS-LRR类基因RPM1、TaNPR2、TaNPR3和TaPR1等)显著上调表达。5.在非生物逆境(干旱和寒冷)胁迫下,与Fielder相比,TaMAPK1-OE或TaNAK1.2-OE小麦的耐旱性和耐寒性显著增强。转录组分析发现,在干旱胁迫条件下,TaMAPK1-OE小麦和野生型Fielder之间共鉴定到708个DEG,其中388个上调,320个下调;GO富集和KEGG分析表明这些DEG主要参与了植物激素信号传导、MAPK信号途径、磷脂酰肌醇信号传导、ABC转运蛋白、转录因子、非生物应答等生物学过程和代谢过程。6.通过小麦c DNA文库的酵母双杂交筛选和多种蛋白质互作技术(Bi FC、Y2H、LCI和Pull-Down等)鉴定和证明了TaMAPK1与小麦TaMAPK1激酶2(TaMAPKK2)、蛋白磷酸酶2C(TaPP2C1)、转录因子TaTGA2.1和TaICE2等互作;TaMAPKK2与TaMAPKKK18互作。7.综合上述结果提出小麦特有的miR5048-TaMAPK1/TaNAK1.2模块协调小麦生长发育与抗逆性平衡的工作模型;即:miR5048-TaMAPK1/TaNAK1.2模块通过TaMAPKKK18-TaMAPKK2-TaMAPK1级联通路进行生长发育或逆境胁迫的信号传递,以及通过TaMAPK1与TaMKP1、TaPP2C1以及转录因子TaTGA2.1和TaICE2相互作用来协调小麦的生长发育和抗逆性之间的平衡,从而促进生长发育或抗逆性相关基因的表达。总之,小麦miR5048的三个部分同源基因位于第VII同源群染色体上,其靶向调控TaMAPK1和TaNAK1的表达;miR5048正调控小麦抽穗期、扬花期和株高,负调控小麦对条锈病的抗性;TaMAPK1和TaNAK1.2负调控小麦株高、穗长、籽粒大小、粒重和单株产量,正调控小麦对生物逆境(条锈菌)和非生物逆境(干旱和寒冷)的抗性;初步揭示了miR5048-TaMAPK1/TaNAK1.2模块调控小麦籽粒大小的细胞学机制以及该模块参与小麦对条锈病抗性、抗旱性和抗寒性的分子机制;并提出了miR5048-TaMAPK1/TaNAK1.2模块协调小麦生长发育和抗逆性的工作模型。