由食源性致病菌引起的食品污染问题对人类健康具有很大的威胁,甚至危及生命,据中国疾病防控中心统计,每年由微生物因素引起的食物中毒占食源性疾病的45%-55%。其中最为主要的就是沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌、大肠杆菌以及弯曲杆菌等。通常食源性疾病发病时都是几种致病菌混合作用导致的。因此,对多种食源性致病菌进行同时精准的检测,是有效防治食源性疾病的重要方法之一。因此,针对常见的三种食源性致病菌,单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),本课题构建了一种多路复用的小孔电阻微球计数的生物传感器(Electrical Resistance Microsphere Counter,ERMC),利用廉价、稳定的多粒径聚苯乙烯微球(Polystyrene microsphere,PM)作为信号报告器,通过小孔电阻进行信号读出,以实现对食源性致病菌快速地定性、定量分析。本课题同时结合超顺磁性纳米颗粒、DNA杂交技术及链霉亲和素-生物素生物放大信号系统,有望实现对三种食源性致病菌的同时、灵敏、高效定量分析。主要研究内容及结果如下:1.基于电阻微球计数生物传感器检测单增李斯特菌的研究本章基于DNA分子杂交技术,结合寡核苷酸探针,利用电阻法微球计数器作为读出设备,构建了一种可灵敏检测致病菌的传感器。通过将所armed forces设计的信号探针固定在3μm聚苯乙烯微球表面,捕获探针固定在1μm的磁颗粒表面,当靶标分子存在时,体系内发生杂交反应形成PM-靶标-磁颗粒的三明治复合物,利用磁颗粒充当磁分离载体,使复合物与未结合的聚苯乙烯微球分离,从而使剩余聚苯乙烯微球的数量能够通过电阻法微球计数器测量,PM数量与L.monocytogenes的DNA浓度具有良好的线性关系,进而实现L.monocytogenes的定量检测。研究结果表明,基于ERMC检测L.monocytogenes的检出限低至17CFU/m L,线性范围可达到10~3 CFU/m L-10~7 CFU/m L,且该方法具有良好的特异性,加标回收率在83%到109.1%。本方法作为一步法进行食源性致病菌的检测具有较好的灵敏度和准确性,且操作简便、价格低廉、耗时短、特异性好,为多目标检测奠定了实践基础。2.基于电https://www.selleck.cn/products/Lapatinib-Ditosylate.html阻微球计数生物传感器检测三种食源性致病菌的研究电阻法微球计数系统因粒径不同会产生不同阻抗效应,可精准区分并灵敏检测不同粒径的微球。本章将3μm、4μm和6μm三种不同直径的PM分别作为检测S.aureus、L.monocytogenes和S.typhimurium的信号探针,构建了一个能同时检测多种目标物的电阻微球计数生物传感器。利用直径为3μm、4μm和6μm的PM作为信号探针,分别在其表面共价偶联寡核苷酸探针,进行DNA杂交反应,通过电阻法微球计数系统统计DNA杂交反应后未反应的PM的数量,从而间接实现对于S.aureus、L.monocytogenes和S.typhimurium的定量检测。研究结果显示:本方法对S.aureus、L.monocytogenes和S.typhimurium的检出限分别为94 CFU/m L、20 CFU/m L和89 CFU/m L,线性范围可达到10~3 CFU/m L-10~7 CFU/m L,检测过程可控制在2 h以内。同时本方法呈现出良好的特异性和准确性,其加标回收率在89%至117%之间,变异系数小于20%。在针对鸡蛋样本进行实际检测时,本方法与实时荧光定量PCR(q PCR)具有较好的一致性。3.基于链霉亲和素-生物素放大系统的小孔电阻微球生物传感器高灵敏检测三种食源性致病菌的研究在食品安全、医疗诊断、环境监测等领域,因一些检测样品基质复杂,所含病原微生物量较少,常需要结合信号放大技术才能达到超灵敏检测的需要。因此本章引入链霉亲和素-生物素放大系统,将捕获探针一端修饰生物素,磁颗粒修饰链霉亲和素,3μm、4μm和6μm三种不同粒径的PM做信号报告分子,结合DNA杂交反应与链霉亲和素-生物素生物信号放大系统,使得磁分离后最终体系中3μm、4μm和6μm PM的数目和三种目标物S.aureus、L.monocytogenes和S.typhimurium的含量形成数量关系。引入链霉亲和素-生物素生物放大信号系统后,该生物传感器检测S.aureus、L.monocytogenes和S.typhimurium的检出限分别为30 CFU/m L、10 CFU/m L、28 CFU/m L,检出限较之前提高了2-3倍,线性范围均可达到10~2 CFU/m L-10~7 CFU/m L,在实际样本检测过程中同样表现出与q PCR良好的一致性。本方法可以实现高灵敏、快速检测三种食Pexidartinib源性致病菌的同时,不需要核酸的预扩增,避免了核酸交叉污染导致的假阳性及假阴性。