研究背景:缺血性脑卒中早期甚至超早期药物溶栓或机械取栓实现血管再通及急性期改善侧支循环治疗是目前最关键和最GSK1120212价格有效的方法。然而上述治疗在改善缺血半暗带区的组织灌注的同时,亦会造成难以避免的继发性神经损伤即脑缺血再灌注损伤(Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury,CIRI)。研究发现,在CIRI早期,自噬可通过清除折叠错误蛋白质和/或老化、受损的细胞器,防止神经元凋亡,以发挥发挥神经保护作用。哺乳动物雷帕霉素靶点复合物1(Mammalian Target of Rapamycin Complex 1,mTORC1)是调节自噬的关键蛋白,其抑制剂雷帕霉素被证实在超早期和早期CIRI中具有神经保护作用。因此,mTORC1有望成为治疗CIRI的重要靶点,从而改善缺血性脑卒中患者的预后。研究目的:1.通过计算机辅助药物筛选技术筛选得到mTORC1的靶向药物。2.通过体外实验验证该药物通过抑制mTORC1激活神经元自噬在CIRI中发挥神经保护作用。实验方法:1.利用计算机辅助药物筛选技术进行mTORC1靶向药物的筛选(1)通过Deep Screening服务器,本研究对靶向哺乳动物雷帕霉素靶点(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)的药物数据集进行深度学习,从而构建mTOR蛋白的药物筛选模型。利用该模型对美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)数据库中的药物进行计算和评分。(2)从PDB蛋白数据库下载mTORC1蛋白晶体结构的FKBP-雷帕霉素结合位点(FKBP-Rapamycin Binding,FRB)序列和抑制剂雷帕霉素的复合物。通过Discovery Studio 4.5(DS 4.5)软件的Libdock模块,将FDA中评分大于0.9的药物以及对照药物雷帕霉素与mTORC1进行对接,并计算Libdock评分。(3)通过DS 4.5的TOPKAT(Toxicity Prediction by Computer AssistedTechnolog,计算机辅助毒性预测)模块、ADME(absorption,distribution,metabolism,excretion,吸收、分布、代谢、排泄)模块分别对Libdock评分较雷帕霉素高的药物进行毒理学和药理学性质分析。随后,选中其中两种药物进行下一步研究。(4)本研究使用DS 4.5的CDOCKER模块对靶蛋白和小分子药物进行精确对接分析,并通过计算CDOCKER相互作用能和相互作用的化学键的数量、种类、键长评估其复合物的亲和力、稳定性。(5)本研究使用DS 4.5的分子动力学模拟分析模块计算配体-蛋白复合物的均方根偏差(Root Mean Square Deviation,RMSD)和势能以评估复合物在自然环境下的稳定性。此外,还使用DS 4.5的3D-QSAR(3D-Quantitative StructureActivity Relationship,三维构效关系)药效基团生成模块揭示了小分子药物和雷帕霉素的药效基团。最后,综合考虑以上所有结果,本研究选择了一个最佳药物进行体外实验验证。2.体外实验验证所选药物能抑制mTORC1激活神经元自噬在CIRI中发挥神经保护作用(1)本研究使用HT22细胞构建了氧糖剥夺/再灌注(Oxygen Glucose Deprivation/Reperfusion,OGD/R)模型。(2)实验分组为正常对照组、OGD/R模型组、OGD/R+小分子药物组、OGD/R+雷帕霉素组、OGD/R+mTOR激活剂组、OGD/R+药物+mTOR激活剂组。(3)采用Western blotting方法测定mTOR、p-mTOR蛋白在各组HT22神经元细胞的表达水平。(4)利用噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium Bromide,MTT)法检测各组HT22神经元细胞相对存活率。实验结果:1.利用计算机辅助药物筛选技术筛选出mTORC1靶向药物维脑路通(1)根据深度学习构建的mTOR蛋白筛选模型分析,FDA数据库中共有559个药物的评分大于0.9。(2)通过Libdock对接分析发现,其中共有13种FDA药物的Libdock评分高于对照药物雷帕霉素。(3)通过ADME和TOPKAT模块的药理学性质和毒理学性质分析显示,这13种小分子药物和雷帕霉素均具有潜在发育毒性。除S2292具有啮齿类动物致癌性,S4523和雷帕霉素具有致突变毒性外,其他小分子药物的药理、毒理学性质均在合理范围内。综合考虑以上结果,我们选择了S2369(维脑路通)和S4690(七叶皂苷)进行进一步研究。(4)通过CDOCKER分析,这两种小分子药物的CDOCKER相互作用能均低于雷帕霉素。相较于雷帕霉素,S2369(维脑路通)和S4690(七叶皂苷)均与mTORC1形成了多种化学键。(5)分子动力学模拟分析结果显示,S4690(七叶皂苷)和S2369(维脑路通)的RMSD和势能曲线与雷帕霉素一样随时间趋于稳定。根据3D-QSAR模块的药效基团分析,S4690(七叶皂苷)和S2369(维脑路通)均比雷帕霉素具有更多的药效基团。由于S2369(维脑路通)比S4690(七叶皂苷)具有更多的药效基团和更稳定的RMSD和势能曲线,本研究选择S2369(维脑路通)进行体外实验验证。2.体外实验验证维脑路通抑制mTORC1激活神经元自噬在CIRI中发挥神经保护作用(1)Western blotting测定结果显示,与OGD/R组相比,OGD/R+维脑路通组(P﹤0.05)、OGD/R+维脑路通+mTOR激活剂组(P﹤0.05)具有mTOR蛋白的显著高水平表达;与OGD/R组相比,OGD/R+雷帕霉素组(P﹤0.01)、OGD/R+维脑路通组(P﹤0.01)、OGD/R+维脑路通+mTOR激活剂组(P﹤0.01)显著降低了p-mTOR/mTOR比值,即mTOR蛋白的磷酸化活化水平确认细节。(2)MTT检测结果显示,与对照组相比,OGD/R组细胞相对存活率明显降低(P﹤0.0001);与OGD/R组相比,OGD/R+维脑路通组细胞相对存活率明显升高(P﹤0.05);相较于OGD/R+雷帕霉素组,OGD/R+维脑路通组的细胞相对存活率明显升高(P﹤0.01)。结论:小分子药物维脑路通是理想的mTORC1靶向抑制剂,并且能通过调控mTORpain biophysicsC1增强神经元细胞自噬在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用。