目的:探究失眠是否是诱发抑郁形成的重要因素之一及其中潜在的生物学机制;在此基础上,探讨油酸(Oleic acid,OA)对失眠诱发抑郁样行为的改善作用。方法:1、选择C57 BL/6小鼠为研究对象,对小鼠进行15天,每天20 h的睡眠剥夺模拟失眠状态。通过旷场实验和高架十字迷宫实验评价小鼠探索欲望与自主行为表现,通过悬尾实验和强迫游泳实验评价小鼠的绝望行为,综合上述神经行为学实验结果共同评价失眠诱发小鼠的抑郁样行为。2、采用激光散斑血流成像和多普勒超声成像采集脑血流量、颈动脉血流量相关指标,评价失眠诱发抑郁小鼠的脑部血流情况。采用LC-MS/MS同时检测小鼠脑中10种在神经系统中具有重要调节功能的神经-内分泌物质水平;采用在体多通道检测小鼠海马组织局部场电位和神经元放电变化,评价失眠诱发抑郁小鼠的脑部神经递质和神经电生理情况。综合以上行为学、脑血流、神经-内分泌和神经电生理的多层次信息,评估失眠是否是抑郁形成的重要因素。3、应用RNA-seq对模型与空白小鼠海马组织的转录本进行全面分析,寻找差异基因并对差异基因进行通路富集分析研究。采用GC-MS对模型小鼠与空白小鼠海马LXH254生产商组织的中长链脂肪酸进行靶向代谢组学分析,观察失眠因素对海马脂肪酸的影响。采用细胞铁死亡PCR Array对小鼠海马组织的90个铁死亡相关基因进行检测,观察失眠因素对海马组织铁死亡基因的影响。采用免疫印迹Western Blot(WB)实验和免疫荧光实验对小鼠海马组织铁死亡标志蛋白(GPX4、ACSL4、DMT1、TFR1)进行检测,观察失眠对小鼠海马组织铁死亡蛋白表达的影响。采用DCFH-DA探针、TBA法和Elisa技术对小鼠海马组织脂质过氧化物(ROS、MDA、4-HNE)含量进行检测,观察失眠对海马组织脂质过氧化的影响。采用透射电镜对小鼠海马组织的细胞形态进行检测,观察失眠对海马组织线粒体等细胞器的影响。综合上述实验探究失眠诱发小鼠抑郁的生物学机制。4、将小鼠分为空白(Control)组、模型(Model)组、油酸给药(OA)组,对各组小鼠进行神经行为学检测,通过旷场实验评价各组小鼠探索欲望与自主行为表现,通过悬尾实验和强迫游泳实验评价各组小鼠的绝望行为,综合评估外源性OA是否能够减轻失眠导致的抑郁样行为。5、对Control组、Model组、OA组小鼠海马组织的ROS含量进行检测,观察外源性OA是否能够减轻造模对小鼠海马组织过氧化的影响。采用透射电镜对各组小鼠海马组织中细胞形态进行检测,观察外源性OA是否能够减轻造模小鼠海马组织线粒体损伤。采用免疫印迹实验和免疫荧光实验对小鼠海马组织铁死亡蛋白(GPX4、ACSL4、DMT1、TFR1)进行检测,评价外源性OA对铁死亡蛋白表达的影响。以此探究OA改善失眠诱发抑郁行为的潜在机制。结果:1、在经历过15天的睡眠剥夺后,模型组小鼠进入旷场中心的时间显著减少(P<0.001),进入旷场中心次数相对减少(P<0.01),总路程和平均速度也出现了显著下降(P<0.05,P<0.01);在高架十字迷宫实验中,模型组小鼠进入开放臂次数比例(OE%)和开放臂停留时间比例(OT%)都出现了显著下降(P<0.05,P<0.05);在悬尾实验和强迫游泳实验中,模型组小鼠表现出不动时间增加(P<0.001,P<0.05)。实验表明在神经行为学上失眠小鼠出现了抑郁样行为,主要表现在:探索行为和自主行为的减弱,绝望行为的增加。2、在脑血量方面,通过小动物超声实验,与空白组对比,模型组小鼠颈动脉的血流速度显著减慢(P<0.01)和血流量显著降低(P<0.01);在激光散斑实验中,模型组小鼠的平均脑血流量显著低于空白组(P<0.05);实验结果说明失眠小鼠不仅在神经行为上表现出了抑郁行为,在脑血流方面也出现了抑郁障碍的表现。通过LCMS/MS对小鼠脑中10种在神经系统中具有重要调节功能的神经内分泌物质进行检测,结果显示,与空白组小鼠对比,色氨酸、5-HT、组氨酸、组胺、多巴胺和GABA浓度在小鼠脑中都出现了显著性下降(P<0.05,P<0.001,P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01),乙酰胆碱、皮质酮、甲状腺素和犬尿氨酸浓度较空白组出现了显著性的升高(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.05),这些神经递质的变化与临床报道抑郁患者脑中的变化趋势是一致的。在体多通道实验结果显示,在经历造模后,模型组小鼠海马CA1区的Theta(4-12 Hz)振荡较空白组小鼠发生了显著性的增强(P<0.01),而模型组小鼠海马区的Gramma振荡(30-100 Hz)较空白组小鼠出现了明显减弱(P<0.01),说明经过造模后,小鼠的记忆、注意、感觉信息处理能力发生了降低,抑郁样行为增加;对海马神经元动作电位进行分析显示,模型小鼠海马组织锥体神经元(兴奋性神经元)瞬时放电频率减少,并且放电间隔增加,放电数目出现了明显的减少(P<0.01);而中间神经元(抑制性神经元)瞬时放电频率增加,并且放电间隔减少,放电数目出现了明显的增加(P<0.01)。综合以上行为学、脑血流、神经-内分泌和神经电生理的多层次信息显示,失眠能够诱发小鼠抑郁形成,表明了失眠是诱发抑郁的重要因素。3、为了探究失眠是如何诱发抑郁样行为发生的,首先对小鼠海马组织进行了转录组分析,结果显示,与空白小鼠相比,模型小鼠上调了159个基因,下调了100belowground biomass个基因;对差异基因进行GO和KEGG富集分析,结果显示海马区差异共表达基因的信号通路主要富集在脂肪酸代谢和谷胱甘肽代谢通路上,有趣的是,这些通路都共同参与了以脂质过氧化为标志的细胞铁死亡的形成。因此,失眠诱发小鼠抑郁样行为可能与细胞铁死亡的发生相关,脂肪酸代谢紊乱和铁死亡发生可能是失眠诱发小鼠抑郁行为的关键。在此基础上,进一步检测了模型小鼠海马组织中的中长链脂肪酸变化情况,通过GC-MS对小鼠海马组织的40个中长链脂肪酸进行靶向代谢组学分析,结果显示,与空白小鼠相比,模型小鼠海马组织脂肪酸含量整体呈现下降趋势,其中单不饱和脂肪酸的变化更突出,特别是OA含量的降低最显著(P<0.001)。铁死亡PCR Array检测结果显示,与空白组相比,模型小鼠的海马组织中与铁死亡相关的14个转录基因发生了显著变化,尤其是铁转运通路中的TFR1和DMT1基因表达均出现明显升高(P<0.01,P<0.05);同时,与脂质过氧化物清除通路相关的GPX4基因表达则显著降低(P<0.05)。这些基因的变化标志着海马组织铁死亡的发生。通过WB和免疫荧光对小鼠海马组织中铁死亡标志蛋白GPX4、ACSL4、DMT1和TFR1检测结果显示,与空白组相比,模型组的ACSL4、DMT1和TFR1蛋白表达显著增加(P<0.001,P<0.001,P<0.0001),而GPX4蛋白则显著降低(P<0.01),这与前期在基因层面的研究结果一致。为了进一步确认失眠诱导抑郁小鼠海马组织铁死亡的发生,对标志性的相关脂质过氧化物ROS、MDA和4-HNE含量进行检测。结果显示,模型小鼠海马组织中ROS、MDA和4-HNE含量均出现显著升高(P<0.01,P<0.05,P<0.001),表明严重脂质过氧化的发生;采用透射电镜对小鼠海马神经元细胞微形态的分析结果显示,与空白组相比,模型组的海马神经元出现了明显的线粒体缩小、线粒体膜密度凝集,线粒体嵴减少或消失的表现。以上结果共同提示,失眠通过影响小鼠海马组织脂肪酸代谢平衡,引起OA含量显著降低,促使海马组织铁死亡发生,影响了海马神经元活性,出现放电频率降低,最终导致小鼠出现抑郁样行为。4、基于之前的研究,采用外源性补充OA的方式来探究外源性OA是否能够减轻失眠诱发的小鼠抑郁样行为。通过神经行为学对各组小鼠抑郁样行为进行评估,结果显示外源性OA能够显著增加模型小鼠在旷场中心的行走路程和进入中心的次数,并且能够显著减少模型小鼠在悬尾和强迫游泳中的不动时间,充分说明OA给药能够减轻小鼠的抑郁症状。5、为了证明外源性OA是否是通过抑制小鼠海马组织铁死亡发生而起到改善模型小鼠抑郁样行为的,对各组小鼠铁死亡现象开展进一步的评估,结果显示外源性OA能够显著减轻铁死亡的脂质过氧化现象和降低线粒体的损伤。值得注意的是,免疫印迹和免疫荧光实验结果表明外源性OA能够显著降低铁转运蛋白DMT1和TFR1的表达(P<0.001,P<0.01),说明外源性OA是通过降低小鼠海马组织铁转运蛋白DMT1和TFR1的表达,减轻铁死亡现象的发生,从而改善小鼠抑郁样行为。结论:1、失眠能够诱发小鼠抑郁行为,其不仅表现在神经NSC 127716分子式行为学上,还表现在脑血流、神经-内分泌和海马神经元放电上,表明失眠是诱发抑郁形成的重要因素之一。2、失眠诱发抑郁行为发生的生物学机制可能是通过破坏小鼠海马组织脂肪酸代谢平衡,降低OA含量,促使铁死亡现象发生,进而抑制了神经元活性,出现放电频率降低,最终导致抑郁行为的发生。3、补充外源性OA能够较好的改善失眠诱导的抑郁样行为,其发挥作用的潜在机制可能与其抑制铁转运蛋白TFR1和DMT1表达,减少小鼠海马组织铁死亡相关。