目的:肺癌治疗失败的主要原因是其发生侵袭转移。上皮间质转化过程在其中发挥出了重要作用。本课题组的前期研究与其他研究均表明新疆传统植物药天山雪莲不仅具有良好的抗肿瘤效果,还可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。但由于其水溶性差,生物利用度低,在实际应用时存在弊端。因此,本课题拟用从天山雪莲中筛选得到的具有抑制肿瘤细胞发生上皮间质转化作用的β-谷甾醇替代胆固醇制备脂质体,并将具有较强抗肿瘤活性的天山雪莲活性化合物粗毛豚草素包载于脂质体。为了增强纳米载体对肿瘤细胞的毒性,改善细胞的摄取,并提高包封率与载药量,将在所制备的脂质体的表面涂覆一层聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯,并修饰ADH-1多肽。以构建一个多功能的纳米靶向载体。为传统中药的进一步研究提供了新的思路与方法,同时促进了现代医学对天山雪莲潜在药物的研发,也为肺癌转移的治疗提供了新的策略,具有重要的研究意义。方法:(1)通过使用高效液相色谱法建立药物粗毛豚草素的含量测定方法学,利用酶标仪建立香豆素6的含量测定方法学;(2)粗毛豚草素脂质体是采用薄膜分散法制备得到的,使用高效液相色谱仪对其包封率进行测定,并采用戊二醛法将ADH-1靶向基团连接在粗毛豚草素脂质体表面,使用三硝基苯磺酸法对脂质体表面靶向基团的连接率进行测定;(3)对制备的天山雪莲功能化纳米载体进行表征考察:借助透射电镜观察所制备各组纳米载体的形貌,所构建纳米载体的粒径、PDI及Zeta电位是采用马尔文粒度仪测定的,分别于4℃、25℃条件下保存载体并对其MLN4924分子式稳定性进行考察,并采用透析法考察所构建纳米载体的体外释药行为;(4)培养A549肺癌细胞;采用MTT法和DAPI荧光标记法分别考察天山雪莲功能化纳米载体对造模前后A549细胞的抗增殖作用;通过采用DHE荧光探针对A549肺癌细胞及TGF-β1造模后A549细胞在给药后细胞内的活性氧的表达水平进行检测;并进一步通过流式细胞仪测定A549肺癌细胞及TGF-β1造模后A549细胞对天山雪莲功能化纳米载体摄取率,从而来考察天山雪莲功能化纳米载体的靶向效果;使用流式细胞仪考察天山雪莲功能化纳米载体对A549肺癌细胞及TGF-β1造模后A549细胞的凋亡作用;(5)通过划痕实验、Transwell迁移以及侵袭实验对天山雪莲功能化纳米载体抑制侵袭转移作用进行评价;并采用Western Blot手段对E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白的表达量进行测定。(6)建立荷A549肺癌小鼠模型,考察天山雪莲功能化纳米载体对荷瘤小鼠的治疗作用。结果:(1)所建立的粗毛豚草素标准曲线线性关系良好,日间、日内精密度及回收率均PHHs primary human hepatocytes符合要求;香豆素6标准曲线线性关系良好,并进一步确定了药物不干扰香豆素6的吸收;(2)以包封率和载药量为指标,进行最佳处方筛选:水化液选取硫酸铵,水化温度控制在60℃,有机试剂选择甲醇,磷脂β-谷甾醇膜材比为3:1,粗毛豚草素药脂比为1:5时最佳。天山雪莲功能化纳米载体中粗毛豚草素的平均包封率为87.25±0.49%,载药量为10.66±0.06%,ADH-1-HIS-LIP组与天山雪莲功能化纳米载体组ADH-1多肽的连接率分别为26.77±0.01%、28.82±0.01%;(3)制备的粗毛豚草素脂质体分布均匀,形态圆整,粒径大小在100 nm附近;制备得到的天山雪莲功能化纳米载体的平均粒径为110.2±0.37 nm,多分散系数为0.10±0.012,Zeta电位为-15.37±0.12 m V;28天的时间内,储存在4℃的天山雪莲功能化纳米载体的粒径、电位及PDI稳定性基本无明显变化,外观颜色无明显变化,时间较长出现轻微的絮状现象;储存在25℃贮存条件下天山雪莲功能化纳米载体,除粒径随着贮存时间的延长出现了轻微的增长及时间较长出现轻微的絮状现象外,PDI及Zeta电位在28天内均较为稳定,稳定性良好。48 h内天山雪莲功能化纳米载体组具有良好的缓释行为,没有明显的突释行为,较游离药物的释放时间明显增长;(4)抗增殖实验结果显示,与粗毛豚草素游离药相比,各组制剂对造模前后A549细胞的抗增殖效果均有所增加,且天山雪莲功能化纳米载体组对造模前后A549细胞的抑制作用最强。IC_(50)分析结果显示,在正常A549肺癌细胞中,天山雪莲功能化纳米载体组的IC_(50)较游离粗毛豚草素组下降了5.93倍。在TGF-β造模后的A549细胞中,天山雪莲功能化纳米载体组的ICCX-5461_(50)较游离粗毛豚草素组下降了14.40倍。从上述结果可以看出,所制备的天山雪莲功能化纳米载体对造模前后的A549细胞均具有较强的抗增殖效果,做成制剂后可以显著增强药物的抗增殖效果,且在造模后A549细胞中的抗增殖效果与增强药物作用的效果更强。在ROS活性氧实验中,天山雪莲功能化纳米载体对造模前后A549肺癌细胞细胞内的ROS水平有显著抑制作用。摄取结果显示,天山雪莲功能化纳米载体进入A549肺癌细胞及TGF-β1造模后A549细胞的量明显多于其他各组。凋亡结果显示,天山雪莲功能化纳米载体对A549肺癌细胞的凋亡作用最强为43.77±11.26%。(5)在划痕实验中,天山雪莲功能化纳米载体的愈合率最低。Transwell细胞迁移实验证明天山雪莲功能化纳米载体组迁移的细胞数量显著降低;Transwell细胞侵袭实验证明靶向组可使穿过小室的A549肺癌细胞减少,抑制A549肺癌细胞的侵袭能力;Western Blotting检测结果可知天山雪莲功能化纳米载体可以上调E-cadherin的表达水平,下调Vimentin和N-cadherin的表达。(6)天山雪莲功能化纳米载体组对荷瘤小鼠肿瘤体积抑制率最高,对体重的影响较小,平均生存时间最长,且对其他组织器官无明显毒性。结论:(1)本实验建立的粗毛豚草素体外含量测定方法学稳定可靠、重现性好;香豆素6的含量测定方法线性良好;(2)薄膜分散法制备的天山雪莲功能化纳米载体方法可重复,包封率与载药量较高,分布均匀、粒径均一,具有缓释效果,稳定性良好;(3)天山雪莲功能化纳米载体可发挥显著的抗增殖效果;天山雪莲功能化纳米载体可以显著抑制细胞内活性氧的表达;天山雪莲功能化纳米载体对造模前后A549细胞的摄取效果最好,且造模后摄取更强;天山雪莲功能化纳米载体可以发挥良好的促凋亡作用;(4)天山雪莲功能化纳米载体可以显著抑制A549细胞的侵袭和迁移,并进一步通过蛋白含量测定结果可知,天山雪莲功能化纳米载体通过调节N-cadherin、Vimentin与E-cadherin蛋白的表达来发挥抑制A549肺癌细胞上皮间质转化的作用。(5)天山雪莲功能化纳米载体可以显著抑制肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的存活时间,提高治疗效果,且安全性强。