大鳞鲃(Luciobarbus brachycephalus)属鲤科(Cyprinidae)、鲃亚科(Barbinae)、鲃属(Barbus),原产于乌兹别克斯坦的咸海。为了促进我国内陆盐碱水域渔业发展,2003年中国水产科学研究院黑龙江水产研究所通过农业部“948”项目首次引进100余尾野生鱼种。2012年实现了大鳞鲃的全人工繁育,目前已推广到全国二十多个省、市地区,产生了较好的经济效益和社会效益。野生大鳞鲃体背部灰黑色,腹部银白色,在养殖过程中部分个体突变为黄色。黄色大鳞鲃具有体色能稳定遗传,驯化集群性好,耐低氧能力强、抗病害等优点,且有较高的观赏价值,是优质养殖品种选育对象。由于大鳞鲃遗传资源匮乏,现有遗传资源不足以支撑经济性状遗传机制解析及新品种的分子育种研究工作,亟需开展大鳞鲃遗传资源开发,促进大鳞鲃品种选育进程。本研究通过组装selleck激酶抑制剂大鳞鲃基因组、构建遗传连锁图谱,以及形态相关性状的QTL性状定位,开发大鳞鲃的基因组资源,并从黄色大鳞鲃体色变异着手,通过转录组差异表达分析和混池转录组测序(bulked segregant RNA-Seq,BSR-Seq),筛选与体色突变有关的基因,验证候选Media attention基因在体色形成中的作用,探索大鳞鲃纯黄体色变异的遗传机制,为大鳞鲃及其它鱼类的体色可控化品种选育提供重要的理论依据和参考。(1)利用Pac Bio测序技术绘制了大鳞鲃基因组草图,基因组草图总长度为1,698.3 Mb,由653个重叠群(contig)组成,重叠群N50长度为4.5 Mb,覆盖了94.01%的基因组序列(k-mer估计的基因组大小为1,806.6 Mb)。基因组注释结果显示,大鳞鲃基因组中共有54,600个蛋白质编码基因。大鳞鲃的基因数量远高于二倍体近亲斑马鱼(Danio rerio)和草鱼(Ctenopharyngodon idellus),与四倍体鲤(Cyprinus carpio)和裂腹鱼(Schizothorax o’connori)相似。92.9%的基因(50,727个)可以获得功能注释。进化分析表明,大鳞鲃与其近缘种露斯塔野鲮(Labeo rohita)分化时间大约在42.6百万年前(Ma)。大鳞鲃基因组中有6,306个基因家族扩张,以及338个基因家族收缩,其中扩张基因家族涉及离子转运、渗透压调节及色素合成等功能。(2)为构建大鳞鲃高密度连锁图谱,本研究对来自1个全同胞家系的146个个体和两个亲本进行了特定位点扩增片段测序(SLAF-Seq)。共获得66,771个单核苷酸多态性(SNP)标记,其中31,019个SNPs被分配到50个连锁群。连锁图谱包含4,304个基因座,总跨度为2,419.2 c M,平均长度为48.4 c M。每个连锁群的长度范围为5.2 c M～76.2 c M,平均间距为0.4 c M～0.8 c M。进一步对大鳞鲃的头宽(HB)、全长(TL)、体高(BH)和体色(BC)4个性状进行了QTL精细定位。BC性状未获得显著性QTL,其余3个性状共获得72个显著性QTL,包括3个HB显著相关QPEG300分子式TL,38个TL显著相关QTL和48个BH显著相关QTL。在这些QTL区域内分别筛选出与BH、TL和HB相关的基因为186、140和5个。(3)对黑色大鳞鲃和黄色大鳞鲃皮肤进行了转录组分析,在去除重复、低质量reads后,分别获得119.0 M和131.6 M有效reads,共组装出163,700条转录本,长度范围201 bp～14,389 bp,N50长度为1,943 bp。差异表达分析共鉴定出855个显著差异表达基因,其中659个基因在黄色皮肤中显著下调,196个基因在黄色皮肤中显著上调。KEGG通路富集结果显示,差异基因显著富集到238条通路,包括黑色素生成、c AMP信号通路、酪氨酸代谢通路、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢等与色素沉着的相关通路。在这些通路中,筛选到与黑色素生成和转移相关的基因6个(ywhae、cdk4、rhoa、mt-ATP6、tuba1、c3),与酪氨酸代谢有关的基因5个(hexa、trinity＿dn34596＿c0＿g1、met、trinity＿dn16612＿c0＿g2、hpd),与黄色素表达相关基因2个(hpd、pvalb7)。经RT-q PCR验证,其表达模式与转录组分析结果一致。(4)为了获得与体色相关的基因,进一步进行了大鳞鲃皮肤混池测序(BSR-Seq)。测序混池分别由黑色亲本皮肤(T1)、黄色亲本皮肤(T2)、全同胞F_1群体中30尾黄色皮肤(T3)和30尾黑色皮肤(T4)构成。混池测序总共产生了496.11 M有效reads,其中四个混池reads分别为43.18 M(T1)、44.12 M(T2)、205.50 M(T3)和203.31 M(T4)。使用GATK软件在两个亲本与两个混池中共检测到1,824,915个SNPs,其中8,978个高质量、高可信度的SNPs用于后续的Δ(SNP-index)分析。按Δ(SNP-index)?0.4筛选到108个显著差异SNPs,这些SNPs位于67个候选基因中,包括酪氨酸酶(tyrosinase)、半胱氨酸型肽酶(cysteine-type peptidase)、锌离子结合蛋白(zinc ion binding)以及含半胱氨酸和组氨酸丰富域蛋白质(cysteine and histidine-rich domain-containing protein)等4个与皮肤色素相关的候选基因。(5)tyr基因是黑色素合成的关键基因,为验证其是否与大鳞鲃黄色体色突变有关,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术探索tyr在大鳞鲃体色形成中的作用。共获得tyr基因敲除F_0代个体697尾,包括331尾黄斑突变表型个体,突变率达到47.49%。根据黄斑面积将突变体分为4类:黄斑面积大于75%(Y75)的突变体55尾(16.62%),黄斑面积小于75%大于50%(Y50)的突变体83尾(25.08%),黄斑面积小于50%大于25%(Y25)的突变体56尾(16.92%),黄斑面积小于25%(Y25-)的突变体137尾(41.39%)。Y75突变体的体表皮肤大部分呈现黄色,在躯干有少量、零散的黑色皮肤分布,黑色素细胞呈树突状,无块状黑色素细胞,黑色素不能完全遮盖周围的黄色素。TA克隆测序结果显示突变等位基因共有9种,3个靶位点中共发生了13种移码突变,66.67%(6/9)的等位基因中提前出现了终止密码子。Y25-突变体的体表皮肤大部分呈现黑色,在头部、躯干有少量、零散的黄色皮肤分布,黑色素细胞呈块状和树突状,能完全遮盖周围的黄色素细胞。突变等位基因共有4种,发生了7种移码突变,25%(1/5)的等位基因中提前出现了终止密码子。Y50和Y25突变体表型介于上述两者之间,体表黑色皮肤和黄色皮肤呈镶嵌状。四种突变体皮肤中tyr及下游tyrp1、dct基因表达量下降,黑色素含量显著降低,而类胡萝卜素含量显著升高。这些结果证实了tyr与大鳞鲃体色突变具有密切相关性。综上所述,本研究绘制了大鳞鲃的基因组草图,构建了大鳞鲃高质量遗传连锁图谱,定位了与BH、TL和HB等形态性状相关的72个QTL,分析了黑色、黄色大鳞鲃皮肤的转录组,获得了855个显著差异表达基因,并通过有参的BSR-Seq分析,筛选出酪氨酸酶、半胱氨酸型肽酶、锌离子结合蛋白以及含半胱氨酸和组氨酸丰富域蛋白质等4个与皮肤色素相关的候选基因,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对黑色大鳞鲃的酪氨酸酶tyr基因进行了敲除,突变体中的黑色素细胞明显减少,取而代之出现了黄色素细胞斑块,证实了tyr在大鳞鲃黄色体色突变中具有重要作用。