目的鉴于OMVs对细菌致病的重要意义,利用超滤浓缩法、超速离心法分离和富集OMVs,并对纯化效率进行分析,再以E.coli-OMVs与巨噬细胞相互作用为切入点,阐明E.coli-OMVs对巨噬细胞线粒体功能和免疫调控作用的影响,为进一步研究E.coli的致病机制和感染防治提供新思路。方法1.E.coli-OMVs的提取及鉴定接种E.coli于LB液体培养基,培养至OD600为0.8时收集菌液。采用超滤浓缩法、差速离心法对细菌OMVs进行提取与纯化。BCA法测定OMV的蛋白浓度、电镜(TEM)检测OMVs形态及纳米颗粒跟踪分析粒径大小分布和浓度。2.E.coli-OMVs对巨噬细胞线粒体功能和免疫调控作用(1)E.coli-OMVs定量与蛋白组学分析提取E.coli-OMVs后进行SDS-PAGE电泳以及蛋白质谱分析,检测E.coli-OMVs的LPS含量。(2)E.coli-OMVs对RAW264.7细胞生存率的影响CCK-8法测定1、5、10、20、50、100μg/ml的E.coli-OMVs对细胞生存率的影响,选择合适的后续试验E.coli-OMVs作用浓度。(3)E.coli-OMVs内化试验Di I标记纯化的E.coli-OMVs与RAW264.7细胞共培养,培养结束后对细胞进行荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察。(4)透射电镜观察E.coli-OMVs对RAW264.7细胞超微结构的影响。(5)E.coli-OMVs对RAW264.7细胞线粒体功能的影响JC-1染色法检测线粒体膜电位变化;检测细胞内ATP水平、ROS水平的变化。(E7080体内实验剂量6)E.coli-OMVs对RAW264.7细胞免疫功能的影响流式细胞术检测RAW264.7细胞的免疫表型;RT-PCR检测细胞因子的变化。结果1.超滤浓缩法和差速离心法提取均能够成功提取E.coli-OMVs,形态典型,镜下可见直径约20~250 nm的球状立体膜结构。但超滤浓缩法提取的E.coli-OMVs粒径分布更为集中,小于250 nm的囊泡比例高于差速离心法制备的E.coli-OMVs,后续实验研究均采用超滤浓缩法。2.对分离的E.coli-OMVs进行了SDS-PAGE分析,银染显示存在大量的蛋白条带,与全菌蛋白条带相比,呈现了较为明显的差异。通过蛋白质组学分析,证明E.coli-OMVs具有丰富的信号转导、免疫应答相关蛋白,以及包括omp C、omp A等在内的致病因子成分。3.用不同浓度E.coli-OMVs作用细胞时,1μg/ml-50μg/ml的浓度范围对RAW264.7的活性影响小。当浓度达到100μg/ml时,细胞存活率仅为45%,呈现明显的细胞毒性,后续实验采用20μg/ml和50μg/ml浓度4.RAW264.7细胞能迅速摄取E.coli-OMVs,细胞出现体积增大、表面伪足样凸起减少、胞内细胞器丰富和线粒体肿胀等超微结构的改变。5.20μg/mlCommunity-associated infection和50μg/ml的E.coli-OMVs作用24 h后,RAW264.7细胞MMP与ATP水平均下降,ROSABT-199抑制剂水平呈剂量依赖性增加,同时促炎细胞因子增加。细胞表面标志物CD86、CD206的表达均升高,CD86分子表达呈现更高的上调水平。结论1.超滤浓缩法具有更高的提取效率,提取的E.coli-OMVs的纯度以及蛋白浓度均高于差速离心法。2.E.coli-OMVs具有丰富的信号转导、免疫应答相关蛋白,以及包括omp C、omp A等在内的致病因子成分,具有免疫生物学活性,可直接与巨噬细胞相互作用并参与免疫反应,引起宿主细胞的氧化应激与机体的炎症反应。