多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)是百合科黄精属的多年生草本植物,是药食两用植物,富含多糖、皂苷、黄酮等多种有效成分,有提高人体免疫力、滋阴润肺等功效。福建省土壤存在重金属(铅、镉等)超标现象,且多花黄精在不同地区发现有重金属(铅)超标;目前对福建省多花黄精重金属分析尚未报道。因此本研究对福建省不同地区多花黄精进行重金属含量进行分析,为福建省多花黄精的安全食用提供数据支撑。对不同浓度铅处理下多花黄精组培苗生长、生理指标等的测定,初步探究铅处理对多花黄精组培苗的影响;研究不同浓度褪黑素(Melatonin,MT)处理对铅胁迫下多花黄精组培苗的生长、生理指标等的最佳缓解浓度;同时对铅胁迫与褪黑素处理下的多花黄精进行转录组和代谢组差异分析,揭示褪黑素对多花黄精缓解铅胁迫的机制,并对多花黄精重金属相关的植物蛋白(Hwww.selleck.cn/products/byl719eavy metal-associated plant proteins,HIPPs/HPPs)基因家族鉴定及表达分析。旨在为深入探讨褪黑素对多花黄精铅胁迫的缓解作用以及调控机制提供理论依据。主要结果如下:(1)福建省不同地区多花黄精重金属含量分析本研究对福建省不同地区多花黄精进行重金属(镉、铜、砷、汞、铅)分析发现,五种重金属含量均在标准限制浓度范围内;为确定药物安全,对多花黄精进行安全风险评估,危害指数>1/暴露限值≤1的风险应予以关注,发现福建省多花黄精重金属含量处于安全范围,但是16个地点铅风险较高;除了邵武沿山野生、邵武沿山人工,其它14个地点汞风险较高;砷有6个地点风险较高,分别为宁化安远野生、德化赤水野生、长汀涂坊人工、长汀濯田人工、长汀梅迳人工、柘荣英山人工。(2)不同浓度铅处理对多花黄精组培苗的影响在重金属含量分析及风险评估中发现福建省多花黄精重金属铅的健康风险最高,因此以组培体系对多花黄精进行不同浓度氯化铅(Lead chloride,PbCl_2)处理,以探究对多花黄精组培苗的产生的影响。首先对多花黄精组培苗进行生长指标分析,发现在1 mM PbCl_2处理后PF-6463922体内实验剂量其叶片萎缩、枯黄严重、生物量下降。进一步对铅处理下多花黄精叶绿素含量、SOD、POD进行分析,发现1 mM PbCl_2处理下多花黄精叶绿素含量、SOD、POD显著下调。此外,对多花黄精组培苗中的多糖、类黄酮进行分析,发现铅处理可促进多花黄精的多糖积累,而在对类黄酮含量的影响较小。因此,1 mM PbCl_2对多花黄精组培苗生长、叶绿素含量、SOD和POD酶活性抑制最显著,对多花黄精组培苗造成胁迫。(3)不同浓度MT处理对多花黄精铅胁迫的缓解作用研究在对多花黄精组培苗进行不同浓度铅处理时发现,1 mM PbCl_2对多花黄精组培苗造成显著胁迫;因此,以1 mM PbCl_Electro-kinetic remediation2为基础,进一步在多花黄精继代培养基中添加不同浓度的褪黑素,研究缓解铅胁迫的最佳褪黑素浓度。结果表明,添加200μM的褪黑素处理后,多花黄精组培苗的萎蔫、叶片黄化、生物量等生长状态得到有效缓解。在对处理后多花黄精组培苗的叶绿素含量进行分析时发现,外施200μM的褪黑素可显著上调叶绿素含量;SOD和POD活性也显著提高。对多糖、类黄酮分析表明,添加200μM褪黑素处理后,多糖和类黄酮含量显著提高。因此,200μM的褪黑素对铅处理下多花黄精的生长、叶绿素含量、SOD、POD多糖、类黄酮的缓解作用最显著。(4)外源MT调控多花黄精缓解铅胁迫组学联合分析在对多花黄精组培苗进行不同天数核损伤观察时发现,在12 d中1 mM PbCl_2与200μM的褪黑素联合处理(MT4)减少铅胁迫引起的核损伤。因此,进一步对多花黄精组培苗(CK)、1 mM的PbCl_2处理的组培苗(Pb4)及添加MT4的组培苗进行转录组测序分析,共获得61.43 Gb的高质量reads,比对率介于80.92-82.86%。在CK-Pb4、CK-MT4、Pb4-MT4的处理组进行成对比较中分别筛选出4673、7368、4181个差异表达基因。KEGG富集分析发现,差异表达基因在内质网对蛋白质的加工和玉米素的生物合成中富集最显著,可能对多花黄精缓解铅胁迫具有重要的调节作用;AMPK、MAPK信号通路相关的β调节亚基、丝裂原活化蛋白激酶、过氧化氢酶等在MT4处理下表达显著上调;类黄酮生物合成途径的氢黄酮醇4-还原酶/黄酮4-还原酶、羟基肉桂酰转移酶在MT4处理下显著上调;在MT4处理中,重金属相关家族HIPPs/HPPs中有4个基因表达显著上调。进一步对CK、Pb4和MT4处理的多花黄精进行代谢组分析,共检测到1649种代谢物,包括氨基酸及其衍生物、酚酸类、核苷酸及其衍生物、黄酮、醌类、木脂素和香豆素等12类。在CK-Pb4、CK-MT4、Pb4-MT4的处理组之间成对比较中分别筛选出217、267、131个差异代谢物。KEGG富集分析发现,差异代谢物在类黄酮生物合成过程、色氨酸代谢为中富集最显著,其中类黄酮在MT4处理后显著上调。同时对转录组和代谢组进行联合分析,发现色氨酸代谢途径和类黄酮生物合成途径是褪黑素缓解多花黄精铅胁迫的关键途径。(5)基于多花黄精转录组的HIPPs/HPPs基因家族鉴定与表达调控对多花黄精转录组数据进行分析时发现,在MT4处理中,重金属相关家族HIPPs/HPPs中有4个基因表达显著上调。因此,进一步对多花黄精HIPPs/HPPs家族进行分析。基于多花黄精不同转录组数据,分别鉴定出68个PcHIPPs和43个PcHPPs基因家族成员。亚细胞定位分析表明,PcHIPPs/PcHPPs基因有73个分布在细胞核内。对多花黄精PcHIPPs/PcHPPs不同组织部位和盐胁迫处理下的表达量进行分析,结果表明,PcHIPPs/PcHPPs基因在多花黄精根状茎中表达上调,在盐胁迫处理48 h时大部分PcHIPPs/PcHPPs基因表现出明显的下调现象。qRT-PCR结果表明,1 mM PbCl_2处理抑制PcHIPPs/PcHPPs基因家族大部分成员的表达,在相同处理中附加200μM MT后PcHIPPs/PcHPPs基因家族的表达量升高。