第一部分基于磁共振-光学多模态影像监测干细胞治疗蒽环类药物慢性心肌毒性的定量评估研究目的:由于广谱强大的抗肿瘤特性,以阿霉素为代表的蒽环类药物被广泛应用于多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤的一线化疗。但是其引起的剂量累积性心脏毒性也日益在临床上受到重视。对儿童肿瘤成年幸存者的长期随访发现,高达30%的阿霉素治疗患者出现了心功能不全的迹象。以阿霉素为代表的蒽环类化疗药物所致的心脏毒性主要表现为进展性且不可逆的心功能不全和心力衰竭,确诊后2年生存率仅为40%。目前,导致恶性肿瘤幸存者长期发病和死亡的原因中,心血管疾病是除肿瘤本身外的第二大原因。多项研究表明干细胞对以阿霉素为代表的蒽环类药物所导致的致死性心肌毒性可能有效。然而干细胞移植入心肌后的生物学行为包括存活时间、分化等机制尚不明确,限制了干细胞的临床应用。因此,对移植干细胞进行在体示踪和移植后生物行为可视化是目前需要解决的重要科学难题。本研究旨在通过把以超小超顺磁纳米颗粒(USPIO)和荧光素酶(Luciferase)双重标记的骨髓间充质干细胞(BMSCs),移植入同品系小鼠阿霉素慢性心肌毒性模型中,以心脏磁共振(CMR)和生物自发光成像(BLI)多模态分子影像来示踪移植后的BMSCs生物学行为。方法:(1)建立阿霉素慢性心脏毒性小鼠模型:选择6-8周龄的Balb/c品系雌性小鼠,腹腔注射阿霉素,剂量为2mg/kg,每周一次,连续6周,停药3月-6个月,通过小动物心脏超声、心脏病理分析包括HE染色、Masson染色和天狼猩红染色来鉴定造模是否成功。(2)分离纯化扩增Balb/c乳鼠来源的骨髓间充质干细胞(BMSCs)并进行鉴定:每次提取BHepatic stellate cellMSCs选择刚出生48小时内的Balb/c乳鼠5只,取双侧股骨、胫骨用注射器对骨髓腔反复冲洗,直到骨髓腔变白。采用贴壁法纯化BMSCs。鉴定已经纯化的BMSCs:采取成骨、成软骨、成脂诱导分化试验和以流式细胞仪鉴定纯化的BMSCs表面特有的分子标志物两种方法。(3)采用USPIO(本研究应用商品化的试剂vivotrax)直接标记和荧光素酶基因(Luc)间接标记骨髓间充质干细胞:首先,以不同浓度(0,10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml)的 USPIO 孵育 Balb/c 乳鼠来源的 BMSCs,孵育时间分别采取4h,12h,24h,48h几个时间点,以cck8法细胞毒性实验来测定vivotrax对BMSCs的细胞毒性,目的是探索vivotrax直接标记BMSCs的安全时间和浓度。其次,荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白(GFP)以慢病毒对BMSCs进行转染,并以嘌呤霉素puromycin筛选稳定表达荧光素酶的细胞株;vivotrax以80μg/ml的浓度孵育BMSCs4小时,实现对BMSCs的安全直接标记。再次,以cck8法测定不同标记方式对BMSCs的增殖活性影响。(4)对干细胞缓解阿霉素心脏毒性机制进行了部分探索:设计分为两组:孵育阿霉素的心肌细胞H9C2,细胞量5X103,直接用新鲜BMSC培养基或者是长满BMSC的细胞上清接种细胞,12h后加DOX刺激,刺激时间为12h,以CCK8法测定细胞增殖活性。(5)对转染luciferase的BMSCs进行体外生物自发光信号测定;96孔板种入200 μl不同数量的细胞(1×106,AMG510试剂5 × 105,2.5×105,1×105,5×104,2.5×104),再加入 150μg/ml的荧光素酶,进行体外自发光成像。(6)对双重标记的BMSCs进行体外磁共振T2、T2*信号检测:24孔板以琼脂糖凝胶接种入不同数量的细胞(1×106,5×105,2.5×105,1×105),7T磁共振进行T2、T2*序列扫描。(7)动物模型体内生物自发光信号检测:将Balb/c慢性心脏毒性小鼠模型随机分为实验组(n=20)和对照组(n=10)。实验组小鼠于心尖及心前区心肌注射Fluc/USPIO-BMSCs,对照组小鼠同样位置心肌注射同样体积的生理盐水,其他实验流程两组小鼠均一致。两组小鼠分别于注射后第1天、第3天、第5天、第7天用IVIS进行BLI检查。(8)动物模型体内磁共振信号测定:由于MRI信号持续时间长达3天,根据文献和预实验结果第4天目标区域的MRI信号无法检测到,因此实验组小鼠和对照组小鼠在第1天和第3天在7.0-T磁共振扫描仪上使用T2、T2*和GRE序列进行扫描。MRI 参数包括:FOV,30×30 mm;matrix,200×200;FA,30;TR,100 ms;NEX,5.0;and TE,6.0 ms。结果:(1)本研究成功建立了阿霉素慢性心脏毒性小鼠模型:采用本论文中的方法,成功率可达100%,至模型成功时动物死亡率极低甚至不死亡。实验组小鼠心脏超声示左心室扩大,EF值明显下降,平均值为51.47%,对照组小鼠EF平均值为86.85%(P<0.05)。实验组小鼠的心肌病理分析:HE染色示心肌细胞中空泡形成,Masson染色和天狼猩红染色示中大量的胶原纤维在心肌间质中形成。(2)分离提取纯化了 Balb/c乳鼠来源的骨髓间充质干细胞并行鉴定:提取的干细胞体外可传代20代仍保持干细胞的特性,行诱导成骨分化实验及茜素红染色示大量矿化结节形成。(3)以商品化的USPIO即vivotrax对乳鼠骨髓间充质干细胞来源的BMSCs进行直接标记,vivotrax对干细胞的细胞毒性实验结果表明:vivotrax的毒性随着孵育时间延长而增加,随着浓度升高对BMSCs的毒性也越大,具体说来,本研究实验结果表明vivotrax孵育BMSCs4小时仅浓度100μg/ml组与对照组细胞活性有显著差异,孵育12小时80-100μg/ml组与对照组细胞活性有显著差异,孵育24小时60-100μg/ml组与对照组细胞活性有显著差异,孵育48小时30-100μg/ml组与对照组细胞活性有显著差异。根据本实验结果,按照安全的原则选择对乳鼠骨髓间充质干细胞来源的BMSCs以80μg/ml浓度孵育4小时。荧光显微镜显示负载荧光素酶和GFP的慢病毒转染乳鼠骨髓间充质干细胞来源的BMSCs效率高。乳鼠BMSCs、以80μg/ml浓度孵育4小时的乳鼠BMSCs、转染荧光素酶的BMSCs、双重标记的BMSCs增殖实验表明,在24小时、48小时的时间点细胞活性无显著差异。但是随着时间延长,双重标记的BMSCs相较于其他组别,细胞活性是下降的。(4)BMSCs上清对阿霉素处理过的大鼠心肌细胞H9C2有保护作用,细胞活性在5h,10h,20h时两组有显著差异。(5)体外荧光信号测定结果:由小动物活体荧光成像仪检测到的光子数值与稳转荧光素酶的小鼠骨髓间充质干细胞数量呈线性关系,公式为y=1766.4寻找更多x+20492(R2=0.9422).(6)体外磁共振信号测定结果:磁共振T2值与细胞不呈线性关系(R2=0.4680)。T2*值与BMSCs数量呈线性关系:y=-18.27x+239.5(R2=0.9342)。(7)动物模型体内自发光信号检测结果:第1天,移植区域的光子信号值为1,040,000± 1,107,488,第3天,移植区域的光子信号值为221,000±159,578.4,第5天为67,700±106,890,荧光信号至第7天时基本不可测出。(8)动物模型体内磁共振结果:T2*序列示心肌注射区域心尖区及心肌前壁信号降低,示双标的干细胞已经移植入该区域。结论:本研究对乳鼠骨髓间充质干细胞进行了 USPIO直接标记和Luciferase间接标记,并将双重标记的干细胞心肌注射至小鼠心尖区,用生物自发光成像和磁共振多模态成像来示踪植入的双重标记的干细胞的生物学行为。对于移植入心肌的双重标记干细胞而言,生物自发光成像更敏感,信号持续时间长,然而并不能精确定位干细胞所在的位置,磁共振成像空间分辨率高,软组织分辨率高,可以多参数、多层面、多角度成像,可以精确定位移植入的干细胞所在位置及迁移路径,以及动物模型心肌病变和心功能信息。多模态成像可以结合不同成像方式的优点,扬长避短,是影像学目前重点研究方向和临床未来的应用趋势。移植入的双标干细胞荧光信号逐渐减弱,一周内消失,说明干细胞在体增殖分化的可能性不大或者不持续,在体干细胞能够发挥治疗的作用应该更加依赖干细胞分泌的细胞因子,因此需要改善移植的方式,例如将干细胞负载在凝胶贴片上,或者提取干细胞外泌体移植入受损心肌。第二部分基于CD137靶向肽的多模态分子探针示踪易损斑块的研究目的:动脉粥样硬化是最常见的血管性疾病,是全球发病率和致死率最高的疾病之一。如何早期预警动脉粥样硬化中的易损斑块(容易破裂和导致继发性血栓形成的斑块)是临床的难点。CD137蛋白在人和小鼠易损斑块中高表达,与稳定斑块和正常血管表达量有显著差异,因此有潜力成为高特异性检测易损斑块的分子影像学靶点。本研究旨在研制以靶向CD137分子的多肽为基础的新型磁共振-光学多模态分子影像探针CD137@Fe3O4/ICG,通过磁共振成像和荧光成像来无创检测易损斑块。方法:(1)通过免疫组化方法测定了 CD137在人和小鼠的动脉粥样硬化组织和正常动脉中的表达量。(2)通过多色免疫荧光确定CD137分子具体表达在易损斑块、稳定斑块及正常血管的何种特定细胞。以OX-LDL分别孵育血管内皮细胞、巨噬细胞系、原代骨髓巨噬细胞,以免疫印迹法测定CD137表达量。使用CD137L孵育稳定表达CD137的脐静脉血管内皮细胞HUVECs及对照组正常HUVECs,CCK8法测定细胞增殖活性。(3)用C57BL/6J背景的(ApoE)-/-的雄性小鼠喂养高脂饮食建立易损斑块动物模型。(4)制备CD137@Fe3O4/ICG探针,并测定理化表征。筛选高亲和力结合CD137的多肽,合成疏水Fe3O4纳米颗粒,通过采用Fmoc固相肽合成策略SPPS最终合成CD137@Fe3O4/ICG。以电镜测定探针纳米颗粒的形态和大小,以MRI测定探针弛豫时间,以高检测灵敏度光学成像系统ivis检测探针荧光信号随浓度变化规律,cck8细胞增值活性试验来检测探针安全性。(5)探针注射动物模型尾静脉内,测定不同时间点荧光、磁共振T2信号变化。结果:(1)在接受颈动脉内膜切除术的人类患者的样本中,免疫组化示易损斑块中CD137的表达水平明显高于稳定斑块或正常动脉组织;小鼠中主动脉和主动脉分支内易损斑块中CD137分子的表达量相对于稳定斑块和正常动脉也是显著增加。(2)免疫荧光显示CD137表达于易损斑块中的血管内皮细胞、活化的炎症细胞、迁移入斑块内的平滑肌细胞和斑块内新生血管的平滑肌细胞。OX-LDL刺激血管内皮细胞CD137表达水平升高,OX-LDL刺激小鼠巨噬细胞系RAW 264.7以及小鼠骨髓原代巨噬细胞CD137表达水平下降。CD137L孵育稳定表达CD137的HUVECscck8实验显示其细胞增殖活性相比对照组显著下降。(3)成功建立了动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型,超声示主动脉弓、腹主动脉、颈动脉等多处斑块形成,病理分析HE染色示斑块阻塞管腔,油红染色示斑块中大量脂质,Masson染色示纤维帽薄甚至断裂。(4)成功制备CD137@Fe3O4/ICG纳米探针,并测定探针理化表征:吸收光谱、ICG发射光谱、Fe3O4@ICG发射光谱、纳米颗粒直径、T2驰豫值可见正文,探针安全性高。(5)CD137@Fe3O4/ICG探针在T2加权磁共振成像上相对于打药前信号降低,与对照组有统计学差异,荧光成像检测示易损斑块动物模型相对于对照组小鼠荧光光强显著增高。结论:本研究研制的纳米探针CD137@Fe3O4/ICG对于检测易损斑块有高特异性和敏感性。