目的:本课题探究由14味中药组成的复方葛根汤抗结肠癌分子机制及拆方优化方案。通过UPLC-MS/MS检测并结合文献查对得出复方葛根汤水提取物化学成分,通过网络药理学预测该方抗结直肠癌的潜在靶点和作用通路,采用体外结肠癌HCT116细胞模型和体内HCT116细胞衍生BALB/c裸鼠肿瘤移植模型,从体内外探究复方葛根汤对结肠癌的药效作用及分子机制;对原方拆方并进行药效实验和亚急毒性实验比较,找到较优的拆方方案;为复方葛根汤治疗结肠癌提供科学数据支撑和优化的拆方。方法:1.复方葛根汤水提取物化学成分检测采用UPLC-MS/MS技术建立复方葛根汤水提取物样品的分析方法,采用Agilent SB-C18色谱柱和ESI源,QQQ扫描采用MRM模式检测复方葛根汤水提取物的化学成分。2.网络药理学预测复方葛根汤治疗结直肠癌的潜在靶点和作用通路通过TCMSP数据库平台及文献报道对复方葛根汤中的五味中药成分按照OB≥20%且DL≥0.1进行筛选,并通过蛋白质库Uni Prot得到活性物质成分的预测靶点,再通过基因表达数据库(GEO)、GEO2R分析、David分析及STRING数据库和Cytoscape 3.9.1软件进行GO功能富集和KEGG通路富集分析,并获得蛋白质互作网络中的结直肠癌疾病相关枢纽基因。3.体外实验实验选取结肠癌细胞株HCT116作为实验模型,设置对照组和给药组。(1)MTTIntrathecal immunoglobulin synthesis法和细胞克隆形成实验检测复方葛根汤对HCT116细胞增殖的影响。(2)细胞形态学观察检测不同浓度复方葛根汤对HCT116细胞形态的影响。(3)细胞划痕实验和Transwell法检测复方葛根汤对HCT116细胞迁移的影响。(4)通过检测活性氧来探究复方葛根汤对HCT116细胞内氧化代谢的影响。(5)蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测各组HCT116细胞内铁死亡相关蛋白GPX4、PTGS2、ACSL4水平及IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、MMP2、TWIST蛋白水平。4.体内实验建立HCT116细胞衍生BALB/c裸鼠异位肿瘤移植模型,设置对照组(给予生理盐水10 m L/kg)和给药组(复方葛根汤剂量1.0 g/kg/d)。(1)每天一次连续灌胃给药23天,每三天测量体重和肿瘤的长和宽,计算瘤体体积,检测复方葛根汤对瘤体增长的影响。(2)最后一次给药后24小时即第24天实验终结时解剖称量瘤重,解剖观察各脏器形态和颜色有无异常并称量心、肝、脾、肺、肾,计算脏器指数。(3)Western Blot法检测对照组和给药组瘤体组织中铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4、PTGS2、ACSL4水平及IL-6、STAT3、p-STAT3、MMP2、TWIST、MMP7蛋白水平。5.拆方优化及亚急毒性比较实验选取结肠癌细胞株HCT116作为实验模型,将复方葛根汤原方(葛根、黄芩、黄连、黄柏、秦艽、泽泻、槟榔、苍术、白术、当归、白花蛇舌草、白头翁、木香、生甘草)按是否有清热解毒或补脾胃功效拆成去三味(去除秦艽、泽泻和槟榔)和秦泽槟(秦艽、泽泻和槟榔),去三味按清热解毒且归大肠或肺经与温补脾胃并归大肠或肺经组合拆成五味(葛根、黄芩、黄连、白花蛇舌草和木香)和六味(黄柏、当归、苍术、白术、生甘草、白头翁),五味按寒性清热解毒的黄芩黄连药对加温补脾胃归大肠经的木香组合拆成三味(黄芩、黄连和木香)和两味(葛根和白花蛇舌草)及二黄(即黄芩黄连药对)。设置对照组和不同药物浓度给药组。(1)MTT法和细胞克隆形成实验检测不同拆方对HCT116细胞增殖的影响。(2)细胞形态学观察检测HCT116细胞在不同拆方不同浓度下形态的变化。(3)细胞划痕实验检测不同拆方在0.0625 mg/m L时对HCT116细胞迁移的影响。(4)KM小鼠每天以3.2 g/kg剂量灌胃一次不同拆方或等体积生理盐水,连续给药14天,每日称量体重,观察小鼠状态;最后一次给药24 h后麻醉处死、剖取小鼠心、肝、脾、肺、肾,观察脏器状况并计算脏器指数,进行亚急毒性比较。结果:1.UPLC-MS/MS检测复方葛根汤化学成分结果从复方葛根汤水提取物中检测并经文献查对得出265种化合物,其中黄酮类89种、萜类63种、酚酸类50种、生物碱类21种、木脂素和香豆素类10种、醌类5种、鞣质类3种、其他类成分24种。2.网络药理学预测复方葛根汤治疗结直肠癌潜在靶点和作用通路共收集到复方葛根汤中五味药98个活性成分,并得到与结直肠癌共同靶点20个,其中前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)与多数活性成分有关;GO富集分析获得63个条目(显著富集51个条目),涉及细胞外间隙,通过信号转导、炎症反应,影响丝氨酸型内肽酶活性等;KEGG通路富集分析获得17个主要条目(显著富集13个条目),主要涉及IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、酪氨酸代谢通路、Toll样受体信号通路、卵巢类固醇生成通路、IL-6/STAT3信号通路等。3.体外实验结果(1)MTT实验结果显示,复方葛根汤对HCT116细胞的增殖有明显的抑制作用,且大致呈浓度和时间依赖性,48 h的IC50约为0.7737 mg/m L。结晶紫细胞克隆形成实验结果显示:与对照组相比,复方葛根汤0.05 mg/m L(P<0.05)及以上浓度处理细胞24 h后能显著降低HCT116细胞形成克隆数,并在0.125 mg/m L(P<0.001)及以上浓度下形成极少数克隆。(2)细胞形态学观察发现复方葛根汤浓度为0.0625mg/m L及更高浓度下的细胞形态变圆、细胞间隙增大、细胞数量减少,且细胞变圆的相对数量与浓度呈正相关,未观察到凋亡形态细胞和凋亡小体。(3)细胞划痕实验和Transwell实验结果显示复方葛根汤对HCT116细胞的迁移有明显的抑制作用(P<0.05、P<0.001)。(4)活性氧检测结果显示,0.125 mg/m L的复方葛根汤显著提高细胞内活性氧含量(P<0.05),导致HCT116细胞氧化堆积,细胞死亡。(5)WePUN30119采购stern Blot结果显示:复方葛根汤显著下调铁死亡相关蛋白GPX4(P<0.05、P<0.01、P<0.001)水平,显著上调铁死亡相关蛋白PTGS2(P<0.05、P<0.01)、ACSL4(P<0.05、P<0.001)水平,显著下调IL-6(P<0.05、P<0.01、P<0.001)蛋白水平以及显著降低p-JAK2/JAK2(P<0.05)、p-STAT3/STAT3(P<0.001)比值,显著下调MMP2(P<0.05、P<0.01)、TWIST(P<0.05、P<0.001)蛋白水平。4.体内实验结果(1)复方葛根汤显著抑制体内HCT116细胞衍生的移植瘤生长。与对照组相比,复方葛根汤明显抑制体内HCT116细胞衍生的移植瘤大小和生长速率(P<0.05)。(2)复方葛根汤组各脏器指数与对照组相比没有显著性差异。(3)Western Blot结果显示:复方葛根汤能显著下调铁死亡相关蛋白SLC7A11(P<0.01)、GPX4(P<0.05)水平并上调铁死亡相关蛋白PTGS2(P<0.01)、ACSL4(P<0.05)水平,显著下调IL-6(P<0.001)蛋白水平以及显著降低p-STAT3/STAT3(P<0.05)比值大小,并显著下调通路下游因子MMP2(P<0.01)、TWIST(P<0.05)、MMP7(P<0.001)蛋白水平。5.拆方优化(1)MTT和细胞克隆形成实验结果显示,去三味组对HCT116细胞的增殖有明显的抑制作用,大致呈时间和浓度依赖性,且抑制作用与原方相仿;MTT结果显示五味、三味、二黄组能明显抑制HCT116细胞的增殖能力,但抑制作用显著低于原方。两味、秦泽槟对HCT116细胞增殖无抑制作用。(2)细胞形态学观察发现去三味处理HCT116细胞24小时后,从0.03125 mg/m L起细胞形态开始变圆、细胞数量减少,且呈浓度依赖性,起效浓度低于原方的0.0625 mg/m L;其它拆方与对照相比形态没有明显变化。(3)细胞划痕实验结果显示去三味对HCT116细胞的迁移有明显的抑制作用(P<0.05),与原方比无显著差异。(4)与对照组比,去三味、五味、二黄减缓了小鼠体重的增长速度且无显著性差异,三味增加小鼠体重的增长速度但也无显著性差异,而原方从第10天起显著减缓了体重增长速度(P<0.05、P<0.01);与对照或去三味比,原方脾脏系数均显著增高,其余诸拆方则无显著差异。结论:1.采用UPLC-MS/MS技术从复方葛根汤水提取物中检测并经过文献查对得出265种化合物。2.复方葛根汤显著抑制HCT116细胞的增殖和迁移,其机制可能是通过下调GPX4蛋白水平、上调PTGS2和ACSL4蛋白水平诱导细胞铁死亡而抑制细胞增长,通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路并下调其下游因子MMP2和TWIST蛋白水平而抑制迁移。3.复方葛根汤能显著抑制体内HCT116细胞衍生的移植瘤生长,其机制可能是通过下调SLC7A1Pidnarulex体外1、GPX4蛋白水平以及上调PTGS2、ACSL4蛋白水平诱导铁死亡抑制肿瘤增长,通过调控IL-6/STAT3通路并下调其下游因子MMP2、TWIST、MMP7和SLC7A11蛋白水平而抑制肿瘤发展。4.去三味抗结肠癌的药效与原方相仿,其它拆方抗癌药效作用均低于复方葛根汤,各拆方均不会显著影响KM小鼠体重增长,而以较高剂量(本研究的3.2g/kg/d)长期服用原方会显著减缓体重增长速度、增加脾脏系数,因此,去三味药效不变而安全性优于原方。