基于SsiCas9蛋白单碱基编辑器的开发和应用

规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)起源于细菌免疫系统,发展到今天已经成为一种高效的基因组靶向技术。通过将脱氨酶与Cas9 nickase(n Cas9)融合,已成功开发出多种胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器(cytosine and adenine base editors,CBEs and ABEs)S63845生产商,可以在细胞和动物模型中诱导高效、低插入和删除(insert and deletion,indels)频率地诱导核苷酸转换,并且可以用以纠正致病的单核苷酸变异(Single Nucleotide Variants,SNVs)。然而,碱基编辑器的应用往往受到特定的原间隔相邻基序(Protospacer adjacent motif,PAM)序列和蛋白质大小的限制。为了进一步扩大能够识别新PAM序列的碱基编辑器工具箱,我们从中华链球菌中intramedullary tibial nail克隆了一个比Sp Cas9更小的Cas9同源物(命名为SsiCas9),可以识别PAM为5′-NNAAAA-3’的基因序列。我们将其分别构建至由APOBEC1或APOBEC3A组成的胞嘧啶碱基编辑器和由Tad A或Tad A*组成的腺嘌呤碱基编辑器中。试验结果表明,由SsiCas9构建的碱基编辑器在多种人类细胞中具有较高的编辑效率、较低的脱靶活性和较低的插入和删除频率。同时,与由基本上无PAM限制的Sp RYCas9构建的BE4max相比由SsiCas9构建的的BE4max在相同位点具有更高的编辑效率。此外,通过显微注射mRNA,SsiCas9介导的BE4max可诱导小鼠Ar基因(R841C)实现高效的C-to-BMS-907351小鼠T转换,在早期小鼠胚胎中介导人类雄激素抵抗综合征相关突变(AR R820C)。因此,我们开发了由Cas9同源物SsiCas9介导的新型碱基编辑器,丰富了碱基编辑的工具箱,并扩大了体外和体内可编辑基因组的范围。