研究背景骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种骨代谢紊乱疾病,随着人口老龄化的发展,OP发病率明显升高,其并发性骨折的严重后果对绝经后女性的身体健康和生活质量构成了严重威胁。OP成为全球公共卫生问题。根据中医理论,肾Q-VD-Oph配制藏精,主骨,生髓。肾精充足,则骨髓化生有源,骨骼得其滋养而强劲有力;肾精亏虚,则骨髓化生乏源,骨骼失其所养而痿软无力,故要补肾填精。左归丸是中医著名的“补肾”方剂,出自《景岳全书》,大量临床、动物实验研究证实了左归丸的抗骨质疏松效应。红曲具有燥胃消食降浊,活血和血而散伤功效,实验证实了红曲能够减少破骨细胞分化,促进骨形成。本研究在左归丸原方基础上加红曲,即左归丸加红曲方,本课题预实验证实,左归丸加红曲方减少去卵巢大鼠骨丢失效果优于左归丸,但目前其机制尚未完全清楚。随着“肠-骨”轴概念的提出,肠道菌群、短链脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFAs)与骨代谢的相关性不断得到证实。OP伴有肠道菌群的改变,肠道菌群的失调也会加重或导致OP,SCFAs由肠道菌群酵解肠道中碳水化合物而来。SCFAs可调节p38MAPK通路抑制破骨细胞(Osteoclast,OC)分化;SCFAs与OC表面的特异性受体GPR41结合,抑制p38MAPK-NFATc1破骨细胞分化通路,抑制前体细胞分化为成熟OC。因此我们选择经典的OC相关通路:SCFAs-GPR41-p38MAPK作为本研究的通路。因此,我们做出如下科学假设:左归丸加红曲方是否调控SCFAs-GPR41-p38MAPK通路发挥抗骨质疏松效应?第一部分:左归丸加红曲方对去卵巢大鼠骨质疏松症的治疗作用及对SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路的影响实验方法1.制备OP大鼠模型,SD雌性大鼠分为空白对照组(NC)、假手术组(SHAM)、模型组(OVX)、戊酸雌二醇组(EV,0.018mg/mL)、左归丸(ZGW,0.945g生药/mL)、左归丸加红曲方组(ZH,1.08g生药/mL)。观察大鼠阴道涂片、称取大鼠体重、子宫湿重来评估造模情况。通过Micro-CT检测大鼠骨密度(BMD)、检测骨组织形态计量学指标、观察骨组织病理改变(HE染色和TRAP染色)2.各组大鼠血清TRAP、BALP和BGP水平(ELISA检测法)、骨吸收相关指标 OPG、RANKL、CTSK、TRAP mRNA(qRT-PCR检测法)和 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白(WB和IHC检测法)表达情况。3.通过16S rRNA基因测序技术检测各组大鼠粪便微生物多样性变化。通过各组大鼠肠道菌群OTU分析图、Alpha和Beta多样性分析观察肠道菌群多样性的变化;在门水平和属水平上分析各组大鼠肠道菌群相对丰度变化和组间差异菌群,观察左归丸加红曲方对去卵巢大鼠肠道菌群多样性和丰度的影响。4.采用气质联用(GC-MS)检测各组大鼠外周血清中SCFAs总量及乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸的含量,结合PLS-DA分析、单变量分析、支持向量机分析,观察左归丸加红曲方对去卵巢大鼠外周血清中SCFAs及差异代谢物的影响。5.qRT-PCR法检测各组大鼠骨组织p38mRNA表达情况;IHC法检测各组大鼠骨组织p38蛋白和WB法检测各组大鼠骨组织GPR41、P-p38蛋白的表达情况,探索左归丸加红曲方对去卵巢大鼠SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路的影响。实验结果1.各组大鼠一般情况表现。造模12周后,假手术大鼠阴道涂片呈现动情前期-动情期-动情后期-动情间期的规律周期变化。去卵巢大鼠阴道涂片呈现持续间期特征,规律动情周期消失。与SHAM组比较,OVX组大鼠体重显著增加(p<0.01);与OVX组比较,EV组、ZGW组、ZH组大鼠体重明显下降(p<0.01)。与SHAM组比较,OVX组大鼠子宫系数显著降低(p<0.01);与OVX组比较,EV组、ZGW组、ZH组子宫系数无统计学差异(p>0.05)。由此可知本实验造模成功。与OVX组比较,EV组、ZGW组、ZH组大鼠BMD、BV/TV 明显提高(p<0.01);Tb.N 显著增加,Tb.Sp 显著降低(p<0.01;p<0.05)。HE染色显示OVX组大鼠骨组织骨小梁结构排列稀疏,结构紊乱,连接性差,且TRAP染色表现为酒红色染色分布较多且明显;EV组、ZGW组、ZH组大鼠骨微结构破损状况均有所改善。2.各组大鼠血清骨转换标志物及骨吸收相关指标的表达情况。ELISA检测结果显示,与OVX组比较,ZH组明显降低TRAP、BALP和BGP水平(p<0.01;p<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,与OVX组比较,EV组、ZH组OPG mRNA表达显著上调(p<0.01),RANKL、CTSK、TRAP 和 RANKL/OPG mRNA 表达明显下调(p<0.01;p<0.05)。IHC检测结果显示,与OVX组比较,EV组、ZH组c-FOS、CTSK、TRAP蛋白表达显著下调(p<0.01;p<0.05)。WB检测结果显示,与OVX组比较,EV组、ZH组c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达明显下调(p<0.01;p<0.05)。3.各组大鼠肠道菌群多样性的变化。由肠道菌群OTU分析、Alpha和Beta多样性分析可知去卵巢后大鼠肠道菌群多样性发生显著变化,以门水平和属水平肠道菌群变化为例,左归丸加红曲方逆转拟杆菌门(Bacteroides)、厚壁菌门(Firmicutes)、Gemmatimonadota、酸杆菌门(Acidobacteriota)、粘球菌门(Myxococcota)5种菌门变化,以及Muribaculaceae、普雷沃菌属(Prevotella)、普雷沃氏菌科 Ga6A1_group 属(Prevotellaceae_Ga6A1_group)、UCG-005、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)5种菌属的变化;由各组大鼠肠道菌群相对丰度变化可知,拟杆菌门和厚壁菌门是门水平的优势菌群,普雷沃氏菌属、拟杆菌属等是属水平的优势菌群,其在各组的相对丰度发生改变。4.各组大鼠肠道菌群代谢物SCFAs含量的变化。与OVX组比较,EV组、ZH组大鼠血清SCFAs总量明显升高(p<0.01)。与OVX组比较,EV组、ZH组戊酸、异戊酸、己酸含量明显升高(p<0.01;p<0.05),其余的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸表现为相同的表达。结合PLS-DA分析、单变量分析和支持向量机分析结果,己酸和异戊酸可能是SCFAs介导的左归丸加红曲方发挥抗骨质疏松作用的关键代谢物。5.SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路确认细节关键因子的表达情况。ZH可激活SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路,显著下调信号通路上p38基因和蛋白表达(p<0.01);提高GPR41蛋白表达、降低磷酸化p38蛋白表达(p<0.05)。第二部分:左归丸加红曲方血清和短链脂肪酸对破骨细胞和SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路的影响实验一:左归丸加红曲方血清用药浓度的筛选实验方法1.制备血清:空白血清组(Serum-NC)、模型血清组(Serum-OVX)、左归丸加红曲方血清组(Serum-ZH)。2.将小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞经RANKL诱导为OC,用TRAP染色进行鉴定。采用CCK-8法筛选左归丸加红曲方血清的安全用药范围。3.采用TRAP染色,观察并计算各组TRAP+破骨细胞个数(细胞核≥3个);对骨片进行骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色,计算骨吸收陷窝面积,确定左归丸加红曲方血清的最佳用药浓度。实验结果1.成功诱导OC。加入RANKL后,镜下观察RAW264.7细胞逐渐融合汇聚,体积增大,并伴有大小不等的囊泡状结构出现。经TRAP染色后,颜色为紫红色、形态多核(细胞核≥3个)者鉴定为成熟OC。2.不同浓度左归丸加红曲方血清对细胞活性的影响。采用CCK-8检测法,确定0%-5%浓度范围的左归丸加红曲方血清对RAW264.7细胞未产生毒性,是安全用药范围。3.不同浓度左归丸加红曲方血清对OC分化的影响。TRAP染色结果显示,与模型血清组比较,不同浓度(2.5%、5%)左归丸加红曲方血清组TRAP+破骨细胞数量均有不同程度的减少(P<0.01),但5%浓度的左归丸加红曲方血清组TRAP+破骨细胞数量减少更明显(P<0.01)。4.不同浓度左归丸加红曲方血清对OC骨吸收功能的影响。与模型血清组比较,不同浓度(2.5%、5%)左归丸加红曲方血清组骨吸收陷窝面积均明显减少(P<0.01),但5%左归丸加红曲方血清组骨吸收陷窝面积减少程度更大。实验二:左归丸加红曲方血清和短链脂肪酸对破骨细胞的影响实验方法1.按照在体实验不同组别外周血中SCFAs含量和比例,采用体外模拟的方法,制备对应组外周血浓度(1×)和骨髓浓度(10×)的SCFAs。实验分组如下:1 × SCFAs-NC、1 × SCFAs-OVX、1×SCFAs-ZH、10×SCFAs-NC、10×SCFAs-OVX、10×SCFAs-ZH。大鼠血清分组:Serum-NC、Serum-OVX、Serum-ZH。2.采用TRAP染色,观察并计算各组TRAP+破骨细胞个数(细胞核≥3个);对骨片进行骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色,计算骨吸收陷窝面积,观察各组大鼠血清和SCFAs对OC分化和骨吸收功能的影响。3.采用qRT-PCR法和WB法检测信号通路关键因子GPR41、p38及OC相关指标基因和蛋白的表达情况。实验结果1.各组大鼠血清和不同浓度SCFAs对OC分化和骨吸收功能的影响1.1对应组大鼠血清和外周血浓度SCFAs对OC分化和骨吸收功能的影响与Serum-OVX组比较,Serum-ZH组明显减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积(p<0.01),而1 ×SCFAs-OVX组减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积效果不及Serum-OVX组(p<0.01);与Serum-ZH组比较,1 ×SCFAs-ZH组减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积效果不及Serum-ZH组(p<0.01)。1.2对应组外周血浓度SCFAs和骨髓浓度SCFAs对OC分化和骨吸收功能的影响与1 × SCFAs-OVX组比较,1 × SCFAs-ZH组明显减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积(p<0.01),10×SCFAs-OVX组减少TRAP+破骨细胞数量(p<0.01)和骨吸收陷窝面积(p<0.05)的程度更明显;与1 ×SCFAs-ZH组比较,10×SCFAs-ZH组减少TRAP+破骨细胞数量和骨吸收陷窝面积(p<0.05)效果更优。2.各组大鼠血清和不同浓度SCFAs对OC相关基因表达的影响2.1对应组大鼠血清和外周血浓度SCFAs对破骨细胞NFATc1、CTSK、TRAP mRNA表达的影响与 Serum-OVX 组比较,Serum-ZH 组 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA 表达明显下调(p<0.01;p<0.05),而 1 ×SCFAs-OVX 组 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA表达明显上调(p<0.01)。与 Serum-ZH组比较,1 ×SCFAs-ZH 组NFATc1、CTSK、TRAP mRNA表达明显上调(p<0.01)。2.2对应组外周血浓度SCFAs和骨髓浓度SCFAs对破骨细胞NFATc1、CTSK、TRAP mRNA表达的影响与 1 ×SCFAs-OVX 组比较,1 ×SCFAs-ZH 组 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA 表达明显下调(p<0.01),10×SCFAs-OVX 组 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA 表达也明显下调(p<0.01;p<0.05);与 1 × SCFAs-ZH 组比较,10×SCFAs-ZH 组显著下调 NFATc1、CTSK、TRAP mRNA 表达(p<0.01)。3.各组大鼠血清和不同浓度SCFAs对OC相关蛋白表达的影响3.1对应组大鼠血清和外周血浓度SCFAs对破骨细胞c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达的影响与 Serum-OVX 组比较,Serum-ZH 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP 蛋白表达明显下调(p<0.01;p<0.05);1×SCFAs-OVX 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达明显上调(p<0.01)。与Serum-ZH组比较,1 × SCFAs-ZH组c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP 蛋白表达明显上调(p<0.01)。3.2对应组外周血浓度SCFAs和骨髓浓度SCFAs对破骨细胞c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达的影响与 1 × SCFAs-OVX 组比较,1 × SCFAs-ZH 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP 蛋白表达明显下调(p<0.01);10×SCFAs-OVX 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP蛋白表达明显下调(pDNA Purification<0.01;p<0.05)。与 1 × SCFAs-ZH组比较,10×SCFAs-ZH 组 c-FOS、NFATc1、CTSK、TRAP 蛋白表达明显下调(p<0.01;p<0.05)。4.各组大鼠血清和不同浓度SCFAs对通路关键因子基因和蛋白表达的影响4.1对应组大鼠血清和外周血浓度SCFAs对通路关键因子p38mRNA和GPR41、P-p38蛋白表达的影响与Serum-OVX组比较,Serum-ZH组p38 mRNA表达明显下调(p<0.01),而1 × SCFAs-OVX组p38 mRNA表达明显上调(p<0.01)。与Serum-ZH组比较,1 × SCFAs-ZH 组 p38 mRNA 表达明显上调(p<0.01)。与Serum-OVX组比较,Serum-ZH组GPR41蛋白表达明显上调(p<0.01),P-p38蛋白表达明显下调(p<0.01);1 ×SCFAs-OVX组GPR41蛋白表达明显下调(p<0.01),P-p38蛋白表达明显上调(p<0.01)。与Serum-ZH组比较,1×SCFAs-ZH组GPR41蛋白表达明显下调(p<0.05),P-p38蛋白表达明显上调(p<0.01)。4.2对应组外周血浓度SCFAs和骨髓浓度SCFAs对通路关键因子p38mRNA和GPR41、P-p38蛋白表达的影响与1 × SCFAs-OVX组比较,1 × SCFAs-ZH组p38 mRNA表达明显下调(p<0.01),10×SCFAs-OVX 组 p38 mRNA 表达也明显下调(p<0.01);与 1 ×SCFAs-ZH组比较,10×SCFAs-ZH组显著下调 p38 mRNA表达(p<0.01)。与1 × SCFAs-OVX组比较,1 ×SCFAs-ZH组GPR41蛋白表达明显上调(p<0.05),P-p38 蛋白表达明显下调(p<0.01);10×SCFAs-OVX 组 GPR41 蛋白表达明显上调(p<0.01),P-p38蛋白表达明显下调(p<0.05)。与1 ×SCFAs-ZH组比较,10×SCFAs-ZH组GPR41蛋白表达明显上调(p<0.05),P-p38蛋白表达明显下调(p<0.05)。实验结论1.左归丸加红曲方可有效改善OP,该效应的发挥与肠道菌群结构的改善,SCFAs含量的提高,SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路关键因子的上调有关。2.左归丸加红曲方干预所致的SCFAs变化可有效抑制破骨细胞分化,该抑制效应是左归丸加红曲方抗骨质疏松效应的一部分。综上,左归丸加红曲方对SCFAs-GPR41-p38MAPK信号通路的调控作用可能是改善去卵巢模型大鼠骨质疏松症的机制之一,验证了“肠-骨”轴的关键中介作用。