我国主要养殖鱼类均存在一定数量的肌间刺,一定程度上影响了其加工和食用价值,还有受伤害的风险。近年来,肌间刺性状已成为鱼类遗传育种研究领域备受关注的改良性状之一。已有研究证明runx2b是鱼类肌间刺形成的关键基因,runx2b基因缺失可以获得稳定的无肌间刺斑马鱼突变体,但尚未有研究聚焦于该基因的无肌间刺经济鱼类的研究。本研究以经济型鱼类团头鲂(Megalobrama amblycephala)为主要研究对象,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,构建缺失runx2b功能的突变体F0代,并筛选出肌间刺减少30%以上的突变体F0代,待其发育至性成熟进行自交繁殖,获得F1代;当F1代的群体生长至四月龄时,通过X光活体扫描F1代个体,筛选无肌间刺团头鲂,随后通过阳性克隆技术检测无肌间刺团头鲂F1代的基因型;采用Micro-CT分析野生型和无肌间刺团头鲂F1代骨骼的骨密度;茜素红整体骨骼染色法和X光扫描技术观察野生型和无肌间刺团头鲂F1代的骨骼发育情况;进一步采用q RT-PCR技术分析骨发育相关基因在野生型和无肌间刺团头鲂F1代尾部肌肉组织中的表达模式,并对野生型(含肌间刺)和团头鲂F1代(无肌间刺)肌肉的营养成分进行了分析。主要研究结果如下:1.团头鲂runx2b突变体F0代的构建、表型及基因表达模式分析本研究通过CRISPR-Cas9基因编辑技术,在团头鲂受精卵的1细胞期之前进行多靶点注射,构建runx2b突变体F0代。采用2%琼脂糖凝胶电泳法检测48h受精卵的突变情况,检测结果为双条带的个体,进一步采用Sanger测序法测序并进行序列比对,靶点附近出现双峰则证明敲除成功;随机选取54尾70dpf的已筛选出的runx2b突变体F0代进行茜素红骨骼染色。结果显示,其中有6尾表现为肌间刺部分缺失的性状,肌间刺缺失的数量分别为43根、7根、17根、14根、7根、14根,肌间刺缺失比率分别为33.86%、5.74%、13.60%、11.48%、5.60%和11.29%。与野生型相比,少刺突变体F0代在背部和尾部均出现肌间刺部分缺失的情况,且脊椎、肋骨等其他骨骼发育正常;采用q RT-PCR技术分析发育到3月龄的runx2b突变体F0代尾部肌肉中骨发育相关基因的表达情况。结果显示,由于团头鲂突变体F0代中runx2b基因的缺失,与矿化相关的基因(entpd5a、entpd5b、spp1、scpp1)在runx2b突变体F0代中的表达量与野生型相比均显著降低(P<0.05),而与肌腱发育相关基因tnmd在runx2b突变体F0代中的表达量与野生型相比没有显著差异(P>0.05)。2.无肌间刺团头鲂突变体F1代的培育、表型及基因表达模式分析为获得无肌间刺的团头鲂突变体F1代,本实验以筛选获得的团头鲂runx2b突变体F0代为基础,选择性成熟、肌间刺减少30%以上的runx2b突变体F0代进行强化培育,挑选发育良好的runx2b突变体F0代作为F1代团头鲂的亲本,自交繁殖获得F1代;随后选择60尾45dpf的runx2b突变体F1代进行茜素红骨骼染色观察表型。结果显示,27尾(占45%)runx2b突变体F1代的肌间刺完全缺失,且其他骨矿化正常,如肋骨、脊椎、神经棘和血管棘。当团头鲂runx2b突变体F1代生长至四月龄时,使用X射线对runx2b突变体F1代进行活体扫描,并从5000尾中筛选出共316尾完全没有肌间刺的团头鲂,MicrHepatitis Delta Viruso-CT结果也进一步明确,runx2b突变体F1代完全没有肌间刺。组织骨密度分析结果显示,生长至4月龄的野生型和runx2b突变体F1代团头鲂的脊椎、肋骨、神经棘、血管棘等骨骼的组织骨密度(tissue mineral density,TMD)值没有显著差异(P>0.05);为探究runx2b基因功能缺失的团头鲂突变体F1代的基因表达模式,随机选取发育到4月龄的runx2b突变体F0代,采用q RT-PCR技术分析其尾部肌肉中骨发育相关基因的表达情况。结果显示,由于无肌间刺团头鲂F1代中runx2b基因SB431542细胞培养的缺失,与骨矿化相关的基因(alpl、bglap、entpd5a、entpd5b)在无肌间刺团头鲂F1代中的表达量与野生型相比均显著降低,且成骨相关基因sp7在无肌间刺团头鲂F1代中的表达量与野生型相比也显示出相对较低的表达水平。3.无肌间刺团头鲂突变体F1代的基因型分析和肌肉的营养成分分析为确定无肌间刺团头鲂突变体F1代的runx2b基因型,随机选择35尾无肌间刺团头鲂F1代进行阳性克隆检测。结果显示,runx2b靶点1、2、3突变类型分别为:靶点1为3种突变类型(1种插入类型,2种缺失类型),插入2 bp,缺失5 bp、8 bp;靶点2为13种突变类型(8种插入,5种缺失类型),插入4bp、5 bp、6 bp、8 bp、9 bp、16 bp、17 bp和25 bp;缺失2 bp、3 bp、4 bp、5 bp和8 bp;靶点3为7种突变类型(1种插入类型,6种缺失类型),插入1 bp,缺失1 bp、2 bp、8 bp、10 bp、11 bp和12 bp。runx2b靶点1、2和3的突变率分别为25.71%、94.28%和71.43%。随后,本研究使用直接干燥法、自动凯氏氮分析仪、自动脂肪分析仪及高温灰化法,检测了生长至4月龄的野生型(含肌间刺)和runx2b突变体F1代团头鲂个体(无肌间刺)的肌肉组织的营养成分。结果显示,有肌间刺和无肌间刺团头鲂个体的基本营养成分相似,其中有肌间刺和无肌间刺团头鲂的粗蛋白、粗脂和粗灰分没有显著差异(P>0.05),且无肌间刺团头鲂的水分高于有肌间刺野生型个体,但没有显著差异(P>0.05)。采用安捷伦气相色谱法测定脂肪酸含量,肌肉中鉴定出14种脂肪酸,即10种不饱和脂肪酸和4种饱和脂肪酸,有肌间获悉更多刺和无肌间刺团头鲂个体大多数脂肪酸没有显著差异(P>0.05)。随后采用自动氨基酸分析仪测定氨基酸含量,肌肉中共鉴定出17种氨基酸,即7种必需氨基酸和10种非必需氨基酸,且无肌间刺团头鲂个体中的大部分氨基酸含量稍高于有肌间刺野生型团头鲂,但无显著差异(P>0.05)。