目的:研究补阳还五汤对急性高原低氧脑损伤的保护作用,通过PI3K/AKT信号通路介导的细胞凋亡探讨其分子机制,为临床防治急性高原低氧脑损伤提供新方法及新靶点,并为补阳还五汤的进一步应用提供依据。方法:1.运用TCMSP、Swiss ADME、Swiss Target Prediction数据库筛选补阳还五汤的有效成分,并进行靶点预测;利用OMIM、Gene Cards数据库获取急性高原低氧性脑损伤的疾病靶点;通过Venny2.1在线平台取交集获得疾病与药物的共同靶点;运用String在线数据库构建疾病与药物PPI蛋白互作图获取补阳还五汤作用急性高原低氧脑损伤的关键作用靶点;再通过Cytoscape3.7.1软件绘制“药物-活性成分-靶点-疾病”网络图;将相应数据通过Metascape在线数据库进行GO分析和KEGG信号通路富集分析。2.低压氧舱模拟高原6000m环境对大鼠进行72h低压低氧处理,复制急性高原低氧脑损伤大鼠模型。成年雄性SD大鼠60只,适应性饲养1天后,随机分为西药(MK-4827试剂胞磷胆碱钠)组(Western Medicine组,WImmune check point and T cell survivalM组,n=12)、急性高原低氧脑损伤模型组(Model组,n=12)、对照组(Control组,n=12)、补阳还五汤低剂量组(Low Dose组,LD组,n=12)、补阳还五汤中剂量组(Medium Dose,MD组,n=12)、补阳还五汤高剂量组(High Dose组,HD组,n=12)。入舱前3天LD组、MD组、HD组给予补阳还五汤水煎液,含生药量分别为0.853g/ml、1.706g/ml、3.412g/ml,20ml/kg/次,Model组予以同体积的生理盐水灌胃,WM组给予2.5g/kg/次胞磷胆碱钠灌胃,给药频次均为1日1次。给药3天后放入低压氧舱,减压至相当于6000m海拔高度72h。Control组大鼠于舱外饲养(海拔2260m),给药同Model组。HE染色法观察大鼠海马神经元形态变化;TUNEL检测海马CA1区神经元凋亡情况,Elisa检测大鼠血清中S100B、GFAP含量变化,Western-Blot检测大鼠海马组织Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、p-Akt、p-PI3K蛋白表达情况。结果:1.(1)利用数据库共获得93个补阳还五汤活性成分和344个急性高原低氧脑损伤相关的靶点基因,通过OMIM数据库、Gene Cards数据库检索并去重后共获得718个急性高原低氧脑损伤的靶点基因,在Venny2.1构建补阳还五汤靶点基因与急性高原低氧脑损伤疾病靶点基因交集,共获得63个交集靶点基因。(2)运用String构建PPI蛋白互作得到了AKT1、IL-6、TNF、TP53、VEGFA、IL-1β、HIF-1α等补阳还五汤治疗急性高原低氧脑损伤的重要靶点;Cytoscape3.7.1绘制“药物-活性成分-靶点-疾病”网络图,显示补阳还五汤治疗急性高原低氧脑损伤的主要成分主要是木犀草素、β–胡萝卜素、杨梅酮、芒柄花黄素等活性成分。(3)GO富集分析发现BP中主要涉及对脂多糖的反应、对氧气水平降低的反应、对激素的反应等,CC中主要涉及膜筏、分泌颗粒腔、受体复合物、细胞器外膜等,MF主要涉及血红素结合、细胞因子受体结合、核受体活性、蛋白激酶结合等。KEGG通路分析发现主要与PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路、JAK/STAT信号通路、Apelin信号通路等信号通路有关,本研究选择PI3K/AKT信号通路进行后续的实验验证。2.(1)HE染色结果:Control组海马区锥体细胞丰富且形态规则,未见明显细胞坏死,Model组一侧海马体的CA3区、两侧DG区均见有少量的细胞胞核固缩深染,锥体细胞排列紊乱且数量明显减少,LD组、MD组可见一侧海马体的CA1区少量细胞胞核固缩深染,少量锥体细胞坏死,HD组、WM组海马体锥体细胞丰富,形态规则,坏死锥体细胞数量明显减少。(2)TUNEL结果:Control组大鼠海马组织可见极少量凋亡神经元,Model组大鼠海马CA1区凋亡神经元数量明显增多,LD组、MD组、HD组、WM组都在一定程度上减少了海马神经元凋亡,但只有HD组与Model组相比有统计学意义(P<0.05)。(3)ELISA结果:与Control组相比,Model组大鼠血清中S100B、GFAP水平均显著增高(P<0.05),经过补阳还五汤、胞磷胆碱钠治疗后,与MoErastindel组相比LD组、MD组、HD组、WM组大鼠血清S100B、GFAP水平均有一定程度降低(P<0.05)。(4)Western-blot结果:Model组大鼠海马组织Bcl-2、p-Akt、p-PI3K蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平显著增高(P<0.01),经药物干预后,MD组、HD组、WM组大鼠海马组织的Bcl-2、p-Akt、p-PI3K蛋白表达水平明显增高(P<0.01),LD组Bcl-2、p-Akt蛋白表达水平明显增高(P<0.01),Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平明显降低(P<0.01),WM组、HD组无显著差异(P>0.05)。结论:1.补阳还五汤治疗急性高原低氧脑损伤是通过多成分、多靶点、多通路发挥作用的,主要涉及PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路、JAK/STAT信号通路、Apelin信号通路。2.采用高原低压氧舱模拟高原海拔6000m环境造模72h后发现大鼠海马组织结构受到破坏,S100B、GEAP血清学水平显著升高,成功复制急性高原低氧脑损伤大鼠模型。3.经补阳还五汤治疗的大鼠,其海马组织结构明显好转,神经元凋亡减少,S100B、GEAP血清学水平降低,表明补阳还五汤对急性高原低氧脑损伤具有保护作用。4.补阳还五汤上调p-PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表达,下调Cleaved caspase-3、Bax蛋白水平,表明补阳还五汤可通过激活PI3K/AKT信号通路,减少神经元凋亡达到治疗急性高原低氧脑损伤的作用。