【目的】本研究通过基于盲肠穿刺结扎模型(CLP模型)自建复合感染脓毒症大鼠模型(MIM模型),结合脓毒症进程甲状腺激素变化,探讨脓毒症对PGC-1α-线粒体生成轴和线粒体功能的影响。并从PGC-1α-线粒体生成轴和线粒体功能角度探讨人参皂苷K对脓毒症肝损伤的保护Z-IETD-FMK作用。【方法】1.脓毒症进程对甲状腺激素、PGC-1α-线粒体生成轴和线粒体功能的影响将48只SD雄性大鼠随机分为空白组(Control),假手术组(Sham)、时间进程组(4h、8h、12h、16h),每组8只,适应性饲养3天后构建MIM模型。术前14h禁食不禁水,造模成功后按时间进程组按时间点取材,Control组和Sham组统一术后16h取材。观察术后16h内大鼠整体生存状态;采用HE染色法检测观察肝脏病理改变;采用ELISA检测血浆中LPS、IL-6、c Tn-Ι,比色法检测ALT、AST、TBil和Cr考察感染、炎症和脏器损伤程度;通过化学发光法检测肝组织中ATP,比色法血浆Lac检测评价能量代谢障碍程度;通过用ELISA法检测血浆中TSH、FT_3和FT_4观察甲状腺功能变化;通过液氧仪检测新鲜肝组织中线粒体Ⅲ态呼吸、Ⅳ态呼吸、呼吸控制率、磷氧比和ATP合成效率,采用罗丹明123法检测膜电位观察线粒体功能变化;通过比色法检测肝组织中MDA和GSH观察氧化应激水平;通过q PCR和WB检测PGC-1α-线粒体生成轴上相关蛋白PGC-1α、TFAM、NRF-1、Nrf-2和SOD2相关蛋白m RNA含量及蛋白表达水平。2.基于PGC-1α-线粒体生成轴和线粒体功能探讨人参皂苷K对脓毒症肝损伤的保护作用将40只SD雄性大鼠随机分为空白组(Control),假手术组(Sham)、生理盐水组(NS)、人参皂苷组(GCK)和阿卡地辛组(AICAR),每组8只。适应性饲养3天后构建MIM模型。造模前12h禁食不禁水,造模前2h给予NS组生理盐水1m L/200g(体重),GCK组给予4.2mg/200g(体重),AICAR组给予14.7mg/200g(体重)给药,统一术后12h取材。病理指标、炎症指标和线粒体相关功能指标的检测方法同第1部分实验。【结果】1脓毒症进程对甲状腺激素水平降低、线粒体损伤程度加深,PGC-1α-线粒体生成轴上相关蛋白有变化趋势复合感染脓毒症大鼠模型建立成功后,随着时间的发展,大鼠术后情况不断恶化,解剖后脏器损伤情况逐渐严重。肝组织HE染色结果同样反映机体内部肝细胞形态逐步被破坏。甲状腺指标TSH、FT_3和FT_4水平逐渐降低,较好的模拟临床上甲状腺功能不全症状,提示能量代谢低下。感染、炎症指标LPS、IL-6水平逐渐增高,提示模型符合脓毒症严重感染要求,且有过度炎症反应。氧化应激指标MDA和GSH水平整体呈上升或下降趋势,在12h增降幅度最大,说明脓毒症条件下氧化应激水平变化剧烈,大鼠线粒体质量不断下降。器官功能指标ALT、AST、TBil、c Tn-I和Cr水平不断呈上升趋势,器官损伤程度不断加深。肝脏线粒体指标中,早期Ⅲ态呼吸耗氧量和Ⅳ态呼吸耗氧量有所增强,而后期Ⅲ态呼吸耗氧量、Ⅳ态呼吸耗氧量、呼吸控制率、P/O比、ATP合成效率和膜电位水平整体呈下降趋势,伴随脓毒症发展上述指标水平逐渐降低。可知脓毒症早期导致的线粒体损伤,线粒体内膜受损。后期呼吸链功能的下降,同时电子漏效应、质子漏效应增强,同时线粒体功能的极度降低。能量代谢指标显示,ATP含量逐渐降低,而Lac含量逐渐增加,说明随着脓毒症发展进程中,机体氧气利用障碍加大,线粒体大量转变成乳酸,同时细胞内ATP水平显著下降,细胞能量代谢低下,能量代谢障碍情况不断加重。PGC-1α-线粒体生成轴指标用qPCR和WB技术检测PGC-1α、NRF-1、TFAM、Nrf-2和SOD2的m RNA相对表达量和蛋白表达量,两者互相印证均提示PGC-1α-线粒体生成轴脓毒症早期激活,但随脓毒症发展被抑制。2人参皂苷K对脓毒症肝损伤有保护作用,线粒体受损程度减轻给药后的复合感染脓毒症大鼠模型建立成功后,肝组织HE染色结果Trichostatin A浓度显示:人参皂苷组较NS组炎性细胞数量减少,肝小叶结构更清晰,肝窦扩张减少,肝板呈放射状但紊乱程度减轻,肝细胞形态基本正常。感染、炎症指标中,给药组LPS含量均大幅升高且含量接近,提示模型大鼠均出现了严重感染,IL-6水平均大幅升高,GCK组和AICAR组均显示出抗炎能力。虽然给药后炎症水平有一定降低,但脓毒症定义决定了感染程度在短时间内仍就较高。氧化应激指标中GCK组和AICAR组MDA水平相似,可知脓毒症大鼠在给予药物的前提下线粒体质量有一定的好转,GSH水平的下降,说明GCK和AICAR均能改善模型动物氧化应激状态。器官功能指标中GCK组和AICAR组的ALT、AST和TBil水平整体有一定下降,提示GCK和ANational Ambulatory Medical Care SurveyICAR可减轻肝脏损伤程度。肝脏线粒体指标显示,给予GCK和AICAR药物后能够改善Ⅲ态呼吸、呼吸控制率、P/O比、ATP合成效率、膜电位,提示GCK和AICAR能够改善线粒体氧气利用障碍,并增强线粒体功能。能量代谢指标中,GCK组和AICAR组的ATP和Lac水平较NS组有一定降低,但给药后两组水平相似。提示脓毒症大鼠在给予药物的前提下能量代谢障碍程度有一定程度减轻。PGC-1α-线粒体生成轴指标用WB技术检测PGC-1α、NRF-1、TFAM、Nrf-2和SOD2蛋白表达量显示:GCK组和AICAR组均能激活PGC-1α-线粒体生成轴,GCK组激活PGC-1α-线粒体生成轴能力更强。【结论】1通过复合感染支架,整合盲肠结扎穿刺法和植入带菌物法建立复合感染脓毒症大鼠模型,本实验室建立的此模型可较好模拟脓毒症的典型过度炎症反应、氧化应激特征和多器官功能障碍等。2脓毒症进程中不同时间点的观察结果显示,复合感染脓毒症大鼠模型可模拟脓毒症低T_3综合症,并同时观察到PGC-1α-线粒体生成轴被抑制,这可能是脓毒症线粒体损伤的一个重要因素。3人参皂苷K可激活PGC-1α-线粒体生成轴,从而改善脓毒症条件下线粒体功能。