目的:本研究以人参皂苷CK为研究对象,结合能量代谢分析仪、荧光染色、免疫荧光等药效评价体系,以线粒体E3泛素连接酶1(Mitochondrial E3 ubiquitin ligase 1,Mul1)参与调控线粒体能量代谢、线粒体自噬和线粒体质量控制为切入点,选定人参皂苷CK中抗神经I/R的皂苷单体并明确其作用机制,为阐述人参皂苷CK对神经细胞OGD/R损伤的核心功效提供思路和可靠的实验依据。方法:1通过无糖无血清培养液及缺氧培养的方法,在高分化的大鼠肾上腺皮质细胞瘤PC12细胞中构建糖氧剥夺/复糖复氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤模型。CCK-8法筛选人参RAD001价格总皂苷中对PC12神经细胞GOG/R损伤有保护作用的单体成分。采用ATP荧光定量试剂盒确定ATP含量,利用线粒体能量代谢仪评价线粒体基础氧消耗、最大耗氧量、呼吸潜力和ATP来源,Western Blot和试剂盒分别检测线粒体呼吸链复合物蛋白表达及酶活。明确人参皂苷CK改善OGD/R损伤诱导的线粒体功能障碍的机制。2通过Mito-tracker活细胞荧光探针观察PC12细胞经OGD/R处理及人参皂苷CK处理48h后形态变化。采用Western Blot对自噬关键蛋白进行分析;腺病毒转染m Cherry-e GFP-LC3B串联荧光探针免疫荧光染色对自噬溶酶体数量进行评价。应用转染小干扰RNA(si-RNA)的方法,在Mfn2沉默的PC12细胞中,通过Mito-tracker、免疫荧光、荧光探针等方法示踪线粒体。明确人参皂苷CK通过Mul1/Mfn2通路调控OGD/R损伤诱导的线粒体自噬。3采用Western Blot分别对细胞浆总蛋白和线粒体总蛋白中Mul1、p-Drp1(S637)、动力学相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)、融合蛋白1(Fission 1,Fis1)、视神经萎缩蛋白1(Optic atrophy protein 1,OPA1)、线粒体融合蛋白1(Mitofusin 1,Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mitofusin 2,Mfn2)蛋白的表达进行评价。利用蛋白质免疫共沉淀的方法,明确Mul1与Mfn2蛋白质相互作用。通过引入抑制线粒体分裂的小分子抑制剂Mdivi-1评价上述关键蛋白的表达。通过Mito-SOX荧光探针研究线粒体内ROS的生成,进一步评价人参皂苷CK对OGD/R诱导的PC12神经细胞凋亡的作用。明确人参皂苷CK基于Mul1/Mfn2通路调节OGD/R损伤诱导的线粒体动力学失衡。结果:1人参总皂苷及皂苷单体人参皂苷Rb2、人参皂苷CK对OGD/R诱导的PC12神经细胞损伤有较明显的保护作用,提高OGD/R后PC12细胞活力。人参皂苷CK预防性处理48h可以显著恢复因OGD/R诱导的PC12细胞损伤模型中ATP含量下降,且ATP主要来源于线粒体内;PC12细胞的基础氧消耗、最大耗氧量、呼吸潜力和ATP明显升高,且呈剂量依赖性。人参皂苷CK对PC12细胞线粒体功能的影响是通过调节其耗氧率(Oxygen consumption rate,OCR)发挥作用的。人参皂苷CK对线粒体复合物蛋白表达没有明显作用,但显著促进了复合物Ⅰ、Ⅲ的酶活,增强线粒体电子传递链的功能。2人参皂苷CK预处理后,OGD/R引起的线粒体过度分裂显著降低。自噬相关关键蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低,正向调控蛋白p62cellular structural biology的表达有明显升高。人参皂苷CK预处理48h后,PC12细胞的Parkin-线粒体共定位荧光强度明显降低,沉默Mfn2后,上述现象被明显抑制。Mfn2沉默后,人参皂苷CK预处理显著减少OGD/R损伤引起的线粒体和溶酶体共定位的效果被抵消。3人参皂苷CK预处理后,评价了胞浆和线粒体蛋白中参与线粒体动力学相关蛋白Mul1、p-Drp1(S637)、Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1、Mfn2的变化情况。其中,Mul1和Drp1表达显著降低;Mfn2表达显著升高。同时,在沉默Mfn2后,人参皂苷CK对OGD/R损伤引起的线粒体过度分裂的调控作用被明显抑制,提示线粒体分裂与Mfn2表达相关。人参皂苷CK预处理可以降低OGD/R损伤中Mul1介导的Mfn2的泛素化和降解;联合抑制剂Mdivi-1后降低了Mul1的表达的更多同时不影响Mfn2的表达,表明线粒体分裂是发生在Mul1通路之后的;人参皂苷CK通过Mul1/Mfn2通路降低线粒体内ROS的生成。结论:1人参皂苷CK通过增加PC12细胞内ATP生成、增强线粒体呼吸能力和电子传递链活性,改善OGD/R诱导的PC12细胞线粒体功能障碍;通过调节Mul1/Mfn2通路,影响线粒体动力学和线粒体自噬关键蛋白表达,减轻OGD/R诱导的PC12细胞损伤。2人参皂苷CK调节Mul1蛋白的表达,降低Mfn2泛素化和降解,以此增加Mfn2的表达,抑制OGD/R损伤诱导的线粒体过度分裂、线粒体自噬和线粒体凋亡。