嗜冷菌(Psychrotrophic bacteria)是最佳生长温度约在15℃或以下,生长的最高温度约20℃,最低温度约在0℃或以下的微生物。作为典型嗜冷菌的小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是重要的食源性细菌,常存在于冷藏食品中。部分小肠结肠炎耶尔森氏菌具有致病性,引起的耶尔森氏菌病(Yersiniosis)可导致肠道感染、肠系膜淋巴结炎等,严重时会危及患者生命。单增李斯特菌会导致严重的胃肠炎、脑炎和败血症等,有较高的死亡率。上述食源性嗜冷菌对全球公共卫生提出了严峻挑战,使冷链食品中嗜冷菌的污染检测成为了食品安全防控中的重中之重。相对于其它细菌,嗜冷菌容易在低温下生长并污染原料食品,所以在冷藏食品生产和流通中需要快速、低成本且灵敏度高的现场检测技术。针对嗜冷菌的现有检测方法各有优势,但多数方法往往检测速度慢、需要大型设备且无法即时反应结果。近年来,规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及CRISPR相关蛋白(CRISPR associated proteins,Cas)所构成的CRISPR/Cas系统逐渐应用到食品检测领域,其中CRISPR/Cas12a蛋白由于通过cr RNA靶向其互补的DNA序列引发非特异性ss DNA切割活性的特性而成为了检测技术研究的热点。这种发光技术搭配简便的检测设备可以实现工厂生产或市场销售环节的现场检测,便于企业或监管部门及时了解食品中嗜冷菌的污染状况,确保食品的卫生安全。本研究利用CRISPR/Cas12a系统结合重组酶聚合酶等温扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术,建立了适用于食源性嗜冷菌现场检测的快速、灵敏的可视化核酸检测方法。具体内容如下:1.分别建立了针对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和单增李斯特菌的荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)方法。加标模拟实验结果表明,小肠结肠炎耶尔森氏菌的qPCR标准曲线方程为:Y=-3.390X+37.00,相关系数(R~2)为0.9986,最低检测限为10~2CFU/g;建立检测单增李斯特菌的qPCR标准曲线方程为:Y=-3.651X+42.31,相关系数(R~2)为0Smoothened Agonist.9796,最低检测限为10~3CFU/g。2.建立了致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的CRISPR/Cas12a-RPA检测方法。该方法以高度保守基因ail为靶标,将RPA与Cas12a系统的可视化相结合。各反应条件优化后,最终确定该RPA的引物浓度480 n M、反应温度37℃和反应时间15 min,该方法可在大约45 min内完成对靶基因的检测。所建立的检测方法特异性强,基因组最低检测限为10~(-6) ng/μL,人工污染猪肉的最低检测限是1.7 CFU/g。该方法只需一个蓝光透射仪即可实现可视化,为一种快速的现场快速检测方法。3.建立了针对单增李斯特菌的CRISPR/Cas12a-MA(CRISPR/Cas12a system with a micro-amplification)检测方法。该方法可以在同一容器内完成单增李斯特菌hly靶基因的扩增和检测,并避免了可能出现的气溶胶污染。并且通过优化RPA扩增体积至5μL,实现扩增反应体系的高效利用的同时显著降低了体系成本。该方法基因组最低检测限为4.7×10~(-9)ng/μL,人工加标猪肉检测限为4.4 CFU/g,并实现在25min内可通过裸眼观测或酶标仪On-the-fly immunoassay测定完成检测,可满足食品中单增李斯特菌的即时检测需求。4.对市场上的各类肉品进行了食源性嗜冷菌的污染情况摸底调查。在检测的47份肉类样品中,致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出率为4.26%,单增李斯特菌检出率为6.38%。其中:在22份预制调理肉品中,致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌和单增李斯特菌检出率均为4.54%;在25份冷冻肉品中,致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检出率为4%,单增李斯特菌的检出率为8%。市场流通的各类肉品中均检出食源性嗜冷菌,建议加强对其监测与管理。在方法应用上,qPCR方法和基于selleck PD-0332991Cas12a的方法在对比分析实际样品时均表现出较好的准确性。基于Cas12a的检测方法所需设备便携、检测时间短且灵敏度高,优于传统的qPCR方法。综上所述,本研究建立了两种针对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法,两种针对单增李斯特菌的检测方法。在样品分析中,两种方法均表现出可靠性。而基于Cas12a的方法相比qPCR具有更高的灵敏度、更快速和可视化的优点。这些方法为食源性嗜冷菌的防控提供了支持与保障。